定點突變

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定點突變(Site-directed mutagenesis),經由設計好的寡核苷酸,在任何一個基因片段上進行隨意或設計好的突變,也就是說,這種突變是預先設定好的,所以也有人將它稱為“反遺傳法”。定點突變由加拿大生化學迈克尔·史密斯發明,他與PCR發明者凯利·穆利斯在1993年共同獲得諾貝爾化學獎

根據生物學,基因會發生突變,突變可以自發也可以誘發。在定點突變法之前,突變株的產生必須經由自然界或用化學等方法讓基因突變,這屬於隨機突變。而突變株必須在生物體上有所改變,才能確定有突變發生。突變位置必須利用分生或化學方法來確定。而定點突變法可經由設計好的寡核苷酸,在任何一個基因片段上進行隨意或設計好的突變,也就是說,這種突變是預先設定好的。

基本原理[编辑]

定点突变的基本流程需要合成一个短的 DNA 引物。其包含了目标突变,并且与突变位点附近的模板 DNA 互补以与目的基因的 DNA 杂交。突变可以是一个碱基的改变(点突变),多个碱基的改变,增加或者删除。这个引物接着被一个 DNA 聚合酶延展,拷贝剩下的基因。拷贝后的基因包含了突变位点,并以载体的形式引入宿主细胞,并被克隆。最后,突变将通过 DNA 测序以确保包含了目标突变。

原始的单引物延展法很低效,突变产量低。产物包含了原有的非突变模板以及突变链,突变及非突变后代混合在一起。此外,模板 DNA 经过甲基化,而突变链未经甲基化,由于偏爱甲基化模板 DNA 的错配修复系统的存在,导致突变数目进一步下降。因此,人们开发了许多新方法来提高突变效率。

方法[编辑]

1.以有配對錯誤的單股DNA分子作為引物,此引物包含想要突變的核苷酸,與載體進行退火後,转化导入细胞内。 2.DNA雙股使用DNA 聚合酶來延長,宿主會產生兩種質體,進行克隆轉譯後即得到突變一個胺基酸的蛋白質。

應用[编辑]

利用分子選殖的方法,可以改變基因上的特定鹼基,送入載體之後,可在宿主中表現。亦可知道特定胺基酸的改變對蛋白質和酵素的影響。