荧光光谱

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某些物质经某波长入射照射后,分子被激发从Sa到Sb,并在很短时间内去激发从Sb返回Sa,发出波长长于入射光的荧光

荧光光谱原理[编辑]

设分子能级为基态Sa激发态Sb

分子在能级Sa和Sb上的分布按照波尔兹曼分布规律:

n_b/n_a=e^{E_b-E_a}=e^{-h\nu/kT}

基态上分子数目变化速率为

	-\frac{dn_a}{dt}=I(\nu)n_aB_ab-I(\nu)n_bB_ba-n_bA_ba

平衡时(稳定态),上式为0: 又有:

迁移几率(爱因斯坦系数

B_{ab}=B_{ba}=\frac{2\pi}{3\hbar^2}D_{ab}

偶极强度

D_{ab}=\mid<\psi_b\mid\underline{\mu}\mid\psi_a>\mid

频率ν处的入射光强

I(\nu)=\frac{8{\pi}h{\nu^3}}{c^3(e^{h{\nu}/kT}-1)}

推导出: Sb通过发射光子从回到Sa的几率,即衰减常数λ

A_{ba}=(\frac{32{\pi^3}{\nu^3}}{3c^3\hbar})\mid<\psi_b\mid\underline{\mu}\mid\psi_a>\mid

Sb上的分子去激发速率

\frac{dn_a}{dt}=-A_{ba}n_b

上式的一个解为

n_b(t)=n_b(0)e^{-A_{ba}t}

可见激发态上的分子数目以指数形式衰减,衰减常数为Aba Sb辐射寿命为(此处参考指数衰减

\tau_R=\frac{1}{A_{ba}}

此仅当吸收的光子和随后发射的光子相同时候有效,即全部吸收的光能量通过辐射过程全部发出光子消耗掉。 而实测时激发态寿命很少和上述寿命一致,因为激发态除了直接发射光子外有很多其他途径失去能量。

Sb通过发出荧光回到Sa的过程的反应速率,即固有荧光速率常数 kF

k_F=A_{ba}=\frac{1}{\tau_R}

Sb回到Sa的其他非辐射途径包括内转变,系统间转变,猝熄作用,其速率常数分别为kIC,kIS,kQ[Q] 则Sb总的去激化(熄灭)常数为kF+kIC+kIS+kQ[Q]

荧光量子产率

\phi_F=\frac{k_F}{k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]}

也可以写作发射光子数/吸收光子数,即发射的荧光光子数/入射光照射时的吸收量

因为大量的非辐射过程的存在,所以激发态实际衰减时间远小于理想的辐射寿命τR 描述此动力学过程

-\frac{d[S_b]}{dt}=(k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q])[S_b]

此方程的一个解为

S_b(t)=S_b(0)e^{-t/\tau_F}

Sb是激发态上的分子数

斯托克斯位移[编辑]

吸收曲线的0,0跃迁与发射曲线的0,0跃迁不重合,之间有一位移,荧光光谱较相应的吸收光谱红移。 原因是分子在处于激发态期间进行了重定向/重排布,消耗了能量,故荧光光谱的0,0峰向低能量(高波长)方向平移。

荧光强度[编辑]

A=\epsilon cl=lg\frac{I_0}{I}

得到

I=I_0 e^{-2.303\epsilon cl}

观测发射强度为

F(\lambda) = 2.303\epsilon clI_0\phi_Ff(\lambda)d=\epsilon\phi_Ff(\lambda)cI_0k

k=2.303ld

给一束脉冲入射光后,发射光在脉冲后的时间t时的强度I(t),与激发态的衰减率dSb/dt及激发态通过荧光衰减的比率φF(量子产率)成比例:

I(t)=\frac{dS_b}{dt}\phi_F=S_b(0)(\frac{\phi_F}{\tau_F}e^{-t/\tau_F}=k_FS_b(0)e^{-t/\tau_F}

随时间表现为指数衰减

系统内有一种荧光物质时:

E_m(t)=Ae^{-t/\tau_F}

系统中有两种荧光物质时:

E_m(t)=A_1e^{-t/\tau_{1F}}+A_2e^{-t/\tau_{2F}}

Em是荧光强度,上述公式为荧光衰减(decay)公式

内部滤光效应[编辑]

对高浓度溶液而言,荧光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系统前半部分被吸收,发射的荧光被再吸收,只有少量的荧光通过狭缝入射到荧光探测器上,使得探测到的荧光强度减少。

外环境影响[编辑]

去激发同样可能由于碰撞或和溶剂分子的混合导致,以速率kQ[Q]发生。和其他过程不同,考虑碰撞时此猝熄是一个双分子过程。 Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])

因为Q通常浓度远大于Sb ,此过程被视为一个伪一级反应,kQ[Q]的值可通过变化猝熄剂Q的浓度,观察对φF的影响测得。芳香类发色基的辐射寿命通常为1*10-9到100*10-9秒。因此,相比较而言,猝熄过程是相当有效率的。普遍的猝熄剂如O2和I-离子,每和激发态分子碰撞一次就会使其去激发一次。此反应速率仅被扩散限制。在微摩尔浓度猝熄剂下,碰撞发生速率为108每秒,因此可以观察到明显的猝熄。

\frac{F_0}{F}=\frac{\phi_0}{\phi}=\frac{k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]}{k_F+k_IC+k_IS}=1+k_Q[Q]

τ0可测,以F0/F对[Q]作图求得kQ

荧光共振能量迁移[编辑]

简称FRET,此过程适用与计算两端带发色基的高分子长度。

存在供体D和受体A,当光入射时,激发基态供体Da→Db,Db又去激发,通过共振将能量传递给Aa,使得Aa→Ab。

定义迁移效率(E)是Db去激发传递能量到Aa占总Db去激发的比例

E=\frac{k_T}{k_T+k_F^D<+k_IC^D<+k_IS^D}

通过一系列复杂的计算和变化,此处省略,得:

k_T=\frac{1}{\tau_0}\frac{R_0}{R}
R_0=9.7*10^3(J\kappa^2n^{-4}\phi_D)^{\frac{1}{6}}  cm
J=\int \epsilon(\nu)f_D(\nu)\nu^{-4}\, d\nu

推导出:

E=\frac{R_0^6}{R_0^6+R^6}

这里R0对一个固定的化学系统而言是常数,R是供体和受体之间的距离,R越接近R0,测计算越精确。

此外计算E的方法有:

\frac{\phi_{D+A}}{\phi_D}=1-E
\frac{F_{D+A}}{F_A}=1+\frac{\epsilon_Dc_D}{\epsilon_Ac_A}E
\frac{\tau_{D,A}}{\tau_D}=1-E

参考文献[编辑]

  • C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.