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西方墨點法

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西方墨點法

西方墨點法英语Western blot)或稱「蛋白質轉漬法」、「免疫墨點法」(immunoblot)或「西式吸印雜交」,是分子生物学生物化学免疫遗传学中常用的一种实验方法,也是HIV檢測的方法之一。

利用特定抗體能夠專一結合其抗原蛋白質的原理來對樣品進行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息,來分析檢測特定蛋白質的生物學檢測技術。

发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为“Western印迹法”。

原理[编辑]

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

實驗步驟[编辑]

實驗大至分為鑄膠、跑膠、轉印、接一級抗體、接二級抗體以及壓片幾個部分。

分类[编辑]

Western Blot显色的方法主要有以下几种:

  • 放射自显影
  • 底物化学发光ECL
  • 底物荧光ECF
  • 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

参考文献[编辑]

外部链接[编辑]

參見[编辑]