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流式細胞術

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流式細胞術是一種生物學技術,用於對懸浮於流體中的微小顆粒進行計數和分選。這種技術可以用來對流過光學或電子檢測器的一個個細胞進行連續的多種參數分析。 流式細胞術(Flow CytoMetry,FCM)是對懸液中的單細胞或其他生物粒子,通過檢測標記的螢光信號,實現高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術。

原理[編輯]

一束單色光(通常是雷射)照到流體力學聚焦的一股流體上。若干個檢測器瞄向流束和雷射相交的這個點,其中一個和雷射在同一直線上(稱作前散射(FSC)),其它幾個和雷射垂直(旁散射(SSC)和一個或幾個螢光監測器)。當每個懸浮顆粒通過光束時會按某種方式把光散射,同時所帶有的螢光化合物被激發並發射出頻率低於激發光的螢光。這些散射光和螢光的組合數據被檢測器記錄,根據各檢測器亮度的波動(每個細胞會顯出一個散射或螢光的峰)就能夠推算出每個顆粒的物理和化學性質。前散射與細胞體積相關,而旁散射取決於顆粒的內部複雜程度(比如核的形狀、胞質內顆粒的種類或者膜的粗糙程度)。

可以檢測的參數有:

  • 細胞的體積和形態複雜程度
  • 細胞中的色素
  • DNA(細胞周期分析、細胞動力學、細胞增殖等)
  • RNA
  • 染色體分析和分選(文庫構建、染色體塗染)
  • 蛋白質
  • 細胞表面抗原(CD標記)
  • 胞內抗原(各種細胞因子(cytokine)、次級媒介等)
  • 核抗原
  • 酶活性
  • pH,胞內離子化的,膜電勢
  • 膜流動性
  • 細胞凋亡(apoptosis)
 1. 定量檢測DNA降解
 2. 粒腺體膜電位通透性變化
 3. 細胞膜上不對稱性的瓦解
 4. 細胞凋亡蛋白質活性偵測(caspase activity)
  • 細胞存活能力
  • 監測細胞電通透性
  • 氧爆作用(oxidative burst)
  • 研究癌細胞中的多重耐藥性(multi-drug resistance, MDR)
  • 穀胱甘肽
  • 各種組合(DNA/表面抗原等等)

這個列表非常長,而且在不斷地擴展。

流式細胞儀(flow cytometer)[編輯]

流式細胞儀又稱螢光激活細胞分選器、螢光活化細胞分類計(FACS,Fluorescence Activated Cell Sorter)。

現代的流式細胞儀每秒可以實時檢測幾千個顆粒,並且可以主動分離具有不同特性的顆粒。

流式細胞儀和顯微鏡比較像,但能夠對大量的單個細胞利用一組參數進行高通量的自動量化。固體組織需要在檢測前製備成單細胞的懸浮液。

一個流式細胞儀包括五個組成部分:

  • 細胞流動系統:液流(鞘液(sheath fluid))攜帶細胞,使顆粒以串流形式通過光束。
  • 光源:有通常的燈(汞或氙)、高功率水冷的雷射源(氬、氪、染料雷射)、低功率氣冷雷射(氬(488nm),紅氦氖(633nm),綠氦氖,氦鎘(紫外))、雷射二極體或雷射二極體倍頻(藍、綠、紅、紫)。
  • 檢測和模數轉換(analogue-to-digital conversion, ADC)系統:產生前散射、旁散射光和螢光的信號。
  • 放大系統,線性或對數放大。
  • 計算機,用於分析信號。

早期的流式細胞儀主要是實驗設備,但目前儀器和相關的試劑有了很廣的市場。不同廠商的儀器特性也不同。

應用[編輯]

流式細胞術在很多領域中都有應用,包括分子生物學病理學免疫學海洋生物學等。在分子生物學中,它主要用於螢光標記的抗體。特異性的抗體與靶細胞上的抗原結合,能夠通過流式細胞儀研究這些細胞的特別信息。這在醫學(尤其是器官移植、血液學、腫瘤免疫學和化療、遺傳學)中具有很廣泛的應用。

現代的流式細胞儀具有多個雷射和螢光檢測器(目前商業用儀器的記錄是4個雷射和14個檢測器),可以用於多個抗體標記,以便在表現型中更準確地區別某個靶群體。

流式細胞儀也是很有用的分選儀器。當細胞/顆粒通過時,可以被選擇性地加上某種電荷,並在通過電磁場後偏轉,從不同出口流出。這樣就可以從一個混合物中高速(理論上可達到每秒大約9萬個細胞)準確地分離開四類細胞。

由流式細胞儀得到的數據可以由新的軟體繪製成一維的柱狀圖(histograms)或是二維甚至是三維的點陣圖(dot plots),進一步由所謂的"圈選"(gates)點陣圖的方式,可將點陣圖的點圖區域不斷地作一系列的分離及再分析。 而特殊的圈選流程(protocols)對於血液學方面在臨床上的診斷有相當的關連性。這類點陣圖經常以對數(logarithmic)尺標的方式來呈現。由於螢光染劑彼此會有光譜波長重疊的情形,而螢光波長呈現的訊號常會被來自螢光接受器的訊號所干擾,因此需由電子運算的方式進行螢光補償(compenstation)

海洋中主要的光合生物之一——佔海洋浮游生物總細胞數將近1/3的原綠球藻(Prochlorococcus)就是通過流式細胞術發現的。因爲其細胞小,葉綠素含量少,在通常的螢光觀察中被迅速漂白(bleach),但由於在流式細胞術中細胞通過光束的時間極短,胞內葉綠素的螢光可被觀察到。

參見[編輯]

外部連結[編輯]