布拉德福蛋白質定量法

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布拉德福蛋白質定量法(Bradford protein assay),亦稱作“考馬斯亮藍法”、“考馬斯藍染色法”(coomassie blue staining),為一種利用光譜學技術分析溶液中蛋白質濃度的技術。本定量法會受待測胺基酸序列影響,此方法為Marion M. Bradford英语Marion M. Bradford醫生所開發。

原理[编辑]

左:布拉德福溶液
右:布拉德福溶液+溶菌酶

布拉德福蛋白質定量法為一種利用比色法測定蛋白質濃度的化驗法。考馬斯亮藍G-250在酸性環境下,會從紅色型態轉為藍色型態,並與蛋白質緊密結合。在形成這個複合物的過程中會經歷兩種反應:紅色態的考馬斯亮藍會先將其自由電子丟給蛋白質的可電離區,造成蛋白質構型改變,並暴露其疏水性區段。於是蛋白質的三級結構會以凡得瓦力與染劑結合。此外,染劑中的負電區會與蛋白質中的正電區相互結合,與蛋白質結合的考馬斯亮藍會因此穩定其藍色構型,造成溶液顏色改變,此時即可利用光譜儀來測量此變化。

与蛋白结合之后的染料,在一段时间(2 分钟到 1 小时)之内,其吸收光谱图在 595 nm 处有一个最大吸收峰。[1] 染料在与蛋白结合前,以阳离子形态存在,显红色或者绿色;与蛋白结合之后,染料分子的阴离子形态被稳定,显蓝色。染料的吸收光谱在 595 nm 处的吸收峰的增加,正比于结合了蛋白质的染料分子数目,故也正比于样品中蛋白质的数目(浓度)。

布拉德福蛋白質定量法与其它测量蛋白的方法不同,不容易受到蛋白质中其它化学成分的影响。

缺點[编辑]

此蛋白质分析法会受几种洗涤剂和中性盐的干扰,如SDS,Triton。 结果也取决于所分析蛋白质中氨基酸的种类。

實驗方法[编辑]

實驗器材[编辑]

實驗步驟(標準分析,濃度:200-1500 µg/mL)[编辑]

  1. 準備一純蛋白質(通常以牛血清蛋白)溶於0.15 M 氯化鈉溶液中,稀釋濃度為250、500、750和1500 µg/mL。並同時以同濃度稀釋待測蛋白質。
  2. 在每個試管加入 100 µL 的稀釋蛋白質
  3. 加入 5.0 mL 的考馬斯亮藍G-250到各試管並混合均勻。
  4. 將光譜儀波長調整至 595 nm,並以無蛋白質的一管作為基準。
  5. 5分鐘後測量各試管在 595 nm 下的吸光值
  6. 畫出標準曲線,計算其吸光係數,並推估蛋白濃度

實驗步驟(微量分析,濃度1-10 µg/mL)[编辑]

替代化驗法[编辑]

其他替代蛋白質化驗法還有:

參考文獻[编辑]

  1. ^ Bradford, M. Marion. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976, 72 (1-2): 248-254 [2015-04-16]. PMID 942051. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3. (原始内容存档于2019-06-14). 

外部連結[编辑]