Taq聚合酶

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Taq聚合酶,外切酶
Taq.png
结合在DNA八聚体上的DNA聚合酶
鉴定
标志 Taq-exonuc
Pfam(蛋白家族查询站) PF09281
InterPro(蛋白数据整合站) IPR015361
SCOP(蛋白结构分类数据站) 1qtm
Taq外切酶
PDB 1ktq EBI.jpg
DNA聚合酶
鉴定
标志 Taq-exonuc
Pfam(蛋白家族查询站) PF09281
InterPro(蛋白数据整合站) IPR015361
SCOP(蛋白结构分类数据站) 1qtm

Taq聚合酶是由钱嘉韵于1976年从嗜热细菌海栖热袍菌Thermus aquaticus)中分离出的DNA聚合酶[1]。Taq聚合酶的常用简称有Taq Pol(或Taq酶)。Taq酶常用于放大短DNA片段的聚合酶链式反应中(PCR)。

海栖热袍菌生活在温泉深海热泉中,从其中分离的Taq酶可承受PCR中所需要的高温[1][2]。因此Taq酶取代了原先用于PCR中的大肠杆菌DNA聚合酶[3]。Taq酶的最适活性温度为75–80°C,在92.5°C时半衰期高于2小时,95°C时为40分钟,97.5°C时为9分钟;Taq酶可在72°C时于10秒内复制一含有1000个碱基对的DNA[4]

Taq酶的缺点之一是缺乏从3'端5'端外切酶校正活性[4],从而导致Taq在复制时保真度不高。原先测得的错误率为每9000个核苷酸中出现1次错误[5]

为了降低出错的机率,科学家陆陆续续发现了其他可以取代Taq聚合酶的聚合酶。举例来说,Pfu是具有3'至5'端外切酵素特性的聚合酶,出错机率约为1/2.6x1000000。但相较于Taq聚合酶,Pfu合成DNA的速度较慢,因此也有混合使用的配方被制作出来。近期的电脑模拟技术以及新兴生物技术,也能透过人工修改Taq酶的结构来增强性能,购买这些商业化的酶可以降低实验的错误率。

Taq聚合酶有一个特性除了合成速度快、出错率高以外,还会使合成的产物“末端带有一个A碱基”,TA克隆即是利用Taq聚合酶此特性,Taq的PCR产物在3'末端会多出一个A,此时只须有一个与其互补的T表现在质体上,即能彼此靠近,借由接合酶连接起来。透过此方式,可省去限制酶剪切的时间,直接利用PCR产物与质体彼此有互补两端的特性,可快速黏合起来。

PCR中的Taq聚合酶[编辑]

二十世纪八十年代初凯利·穆利斯鲸鱼座集团英语Cetus Corporation研究DNA合成在生物科技上的应用。穆利斯熟悉DNA寡核苷酸作为目标DNA探针、作为DNA测序引物、作为cDNA合成引物的技术。穆利斯在1983年开始尝试将两个引物与目标DNA片段杂交后加入DNA聚合酶,此方法可以实现指数级别的DNA复制[6],放大了两前体中间的DNA片段[3]。但在每轮复制后需要将混合物加热到90°C以上使新合成的DNA熔解;两条DNA链分开后方可成为下一轮复制的模板。在发现Taq酶之前,加热过程也会使当时使用的大肠杆菌DNA聚合酶I失活。Taq酶的应用使PCR可在高温下进行(~60°C),有助于提高引物专一性、减少非特异性产物。PCR只需在封闭试管中配合相对简单的热循环仪英语thermal cycler上进行。因此Taq酶是解决分子生物学中众多有关DNA分析的问题的基石[2]

参见[编辑]

脚注[编辑]

  1. ^ 1.0 1.1 Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bact. 1976, 127 (3): 1550–7. PMC 232952. PMID 8432. 
  2. ^ 2.0 2.1 Saiki, RK; et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.. Science. 1988, 239 (4839): 487–91. PMID 2448875. doi:10.1126/science.2448875.  [失效链接]
  3. ^ 3.0 3.1 Saiki, RK; et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985, 230 (4732): 1350–4. PMID 2999980. doi:10.1126/science.2999980. (原始内容存档于2008-12-19). 
  4. ^ 4.0 4.1 Lawyer FC; 等. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase .... PCR Methods Appl. 1993, 2 (4): 275–87. PMID 8324500. 
  5. ^ Tindall KR and Kunkel TA. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry. 1988, 27 (16): 6008–13. PMID 2847780. doi:10.1021/bi00416a027. 
  6. ^ Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci. Am. April 1990, 262 (4): 56–61, 64–5. PMID 2315679. doi:10.1038/scientificamerican0490-56.