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革兰氏染色

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经革兰氏染色的两种细菌,紫色者为阳性金黄色葡萄球菌(ATCC 25923 菌株),粉红色者为阴性大肠杆菌(ATCC 11775 菌株)

革兰氏染色(英语:Gram stain)是用来鉴别细菌的一种方法:这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(英语:Gram Positive)与革兰氏阴性(英语:Gram Negative)。这一染色方法由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明,最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系[1],后推广为鉴别细菌种类的重要特性之一,对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗有着广泛用途。

革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌抗生素的反应并不一样,因而通过抽取样品医生可以在很短的时间内(5分钟左右)确定细菌的革兰氏性质,医生从而可依据结果初步判断,迅速给病人注射抗生素,而不需要等待几天细菌培植得到的化验结果。然而并非所有的细菌都可以通过革兰氏染色归类,如分歧杆菌等则需进行抗酸染色鉴别[2]

染色结果

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革兰氏染色结果示例
经革兰氏染色的大肠杆菌(革兰氏阴性菌)
经革兰氏染色的大肠杆菌革兰氏阴性菌)
经革兰氏染色的金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌)
经革兰氏染色的金黄葡萄球菌革兰氏阳性菌)

革兰氏染色的对象是细菌细胞壁。染色后的细菌可在显微镜下更好的观察,以便于区分。不同的细菌在该染色法的作用底下反应不同,藉以主要区分成为以下的类型:

革兰氏阳性菌

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革兰氏阳性菌,胞壁染色后呈蓝紫色

革兰氏阴性菌

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革兰氏阴性菌,染色后呈红色

不确定或者多变

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一些细菌经过革兰氏染色之后显示出多种颜色,如同时出现紫色和粉色的细胞[3]

另一些的染色结果则是随机的,无法被归类于革兰氏阳性或阴性。

除此之外,对于所有细菌来说,培养的时间都可能影响染色结果[3]

染色流程及原理

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流程可概括为:染色-脱色-复染。

  • 第一步:初染剂(Primary Stain)

使用结晶紫[注 1]染色,染色部位主要为染细胞壁上的肽聚糖。

  • 第二步:媒染剂(Mordant)

加入复方碘溶液或称革兰氏碘液(Gram's Iodine)后,两者会形成不溶性的结晶紫-碘(CV-I)复合体。细菌呈紫黑色。第二步是关键,它的目的是分辨细菌的革兰氏染色特性。若为革兰氏阳性菌,此复合体系结合于细胞壁之镁、核糖核酸(Magnesium Ribonucletic Acid),形成镁-核糖核酸-结晶紫-碘(Mg-RNA-CV-I)复合体,不易脱去,染剂也就固定下来了。

  • 第三步:脱色剂(Decoloring Agent)

使用酒精(95%)脱色,试剂具脂溶剂(Lipid Solvent)和蛋白脱水剂(Protein Dehydrating Agent)之双重功能。此步骤对革兰氏阳性细菌无效,因为其细胞壁上厚厚的细胞壁(成分为肽聚糖)层次多,交联致密,故遇脱水时网孔缩小,再加上不含类脂,使得乙醇不会溶出缝隙,因此阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗,仍然呈紫色只能留在细菌体内。革兰氏阴性菌细胞壁层薄,外膜类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差,在遇脱色剂时,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡复合体溶出,因此会被脱色而成为无色。

  • 第四步:复染剂(Counterstain)

为了对比,在此之后会加入番红(Safranin)进行复染,革兰氏阴性菌成红色,而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色。[4]

定性

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KOH-试验

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另外的一种方法是氢氧化钾-试验。将培养好的细菌取出一小部分,使其悬浮于一滴KOH溶液中。革兰氏阳性菌与之不发生反应,用细针穿过该溶液,溶液呈正常液体状。革兰氏阴性菌因细胞壁中主要成分为脂多糖,脂质含量较高,接触强碱KOH后与KOH发生皂化反应,以细针穿过会有明显黏稠状。

氨肽酶试验

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除了个别例外,只有革兰氏阴性菌才能证明氨肽酶的存在。这是该试验的基础。 将要进行试验的细菌放入试管加水。放入一张显示肽酶活性的试纸,在37°C下等待10到35分钟,试纸变成深黄色。

参见

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外部链接

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参考文献

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注释

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  1. ^ 结晶紫(英语:crystal violet)或称龙胆紫(英语:gentian violet),也称“甲基紫10B”。

引用

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  1. ^ Colco, R. Gram Staining. Current Protocols in Microbiology. 2005, 00 (1): Appendix 3C. ISBN 978-0471729259. PMID 18770544. doi:10.1002/9780471729259.mca03cs00. 
  2. ^ THE ACID FAST STAIN. Georgia Highlands College. [2017-06-09]. (原始内容存档于2017-06-10). 
  3. ^ 3.0 3.1 Beveridge, Terry J. Mechanism of Gram Variability in Select Bacteria. Journal of Bacteriology. March 1990, 172 (3): 1609–1620. PMC 208639可免费查阅. PMID 1689718. doi:10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990. 
  4. ^ 微生物学(第8版十二五普通高等教育本科国家级规划教材): 第三章. 2016. ISBN 9787040444957.