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南方墨點法

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南方墨點法南方吸漬分析(英語:Southern blot),是由英國生物學家Sir Edwin Southern於1975年發明,並因此得名(Southern為南方之意),是一種普及的分子生物學實驗技術。目的是偵測經由膠體電泳分離的樣品中,含有特定序列的去氧核糖核酸片段。

通常,先利用膠體電泳分離去氧核糖核酸(DNA)樣本中各種不同大小的分子。不同大小的分子在膠體電泳之後,會分離而散布在膠體上不同的位置。接著,這些DNA分子可以利用虹吸作用,轉染到一個薄膜上,經由DNA變性使它們的雙股分開。因為雙股DNA已經固定在薄膜上,所以變性後無法再形成雙股螺旋;然後將上述薄膜暴露在雜交探針(probe)裡,讓探針和DNA雜交(hybridize)。探針是會產生放射線、或可以放出顏色或螢光的物質標記的單股DNA或核糖核酸(RNA)片段;最後是觀察結果。薄膜上可以偵測到放射性或者螢光訊號的位置,就是含有可以與探針核酸序列進行偶合的去氧核糖核酸樣本散布的位置。

類似的技術也被用來偵測經由膠體電泳分離的樣品中,含有特定序列的RNA片段,當應用在RNA的偵測時,被稱為北方墨點法

基本原理及過程概述[編輯]

基本原理[編輯]

Southern雜交是利用標記的探針(probe)與轉印膜上把DNA片段進行雜交的技術,檢測DNA片段中是否存在與探針同源的序列。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針(序列已知)進行特異性的靶序列檢測。

Southern blot的基本過程[編輯]

  1. 從細胞或組織中用酚/氯仿反覆抽提蛋白質並用無水乙醇沉澱的方法製備基因組DNA(gDNA);
  2. 限制性酶切基因組DNA;
  3. 將酶切產物電泳分離(electrophoretic separation);
  4. 毛細轉印或電轉印並固定於NC膜或尼龍膜上;
  5. 在膜上與標記探針雜交;
  6. 洗膜後可觀察雜交結果。

實驗步驟[編輯]

製備待測DNA樣品[編輯]

  • 將新鮮組織研磨成勻漿收集細胞或培養好的細胞用胰酶處理後收集,先反覆用酚處理細胞兩次後,加入氯仿抽提蛋白質。用乙酸銨和無水乙醇沉澱DNA,並用70%乙醇洗滌一次,加入TE緩衝液溶解。在用洋菜糖凝膠電泳確認基因組DNA成功提取後,加入限制性內切酶消化,過夜反應。

洋菜糖凝膠電泳[編輯]

  • 製備0.8%-1.0%的凝膠,用0.5*TBE作電泳緩衝液,根據膠的長度,在1V/cm的電壓下電泳,至上樣緩衝液(如溴酚藍等)到達特定位置停止。

DNA變性[編輯]

  • DNA受酸、鹼、熱等處理均能發生變性,但強酸會使核酸降解。一般認為鹼變性較好,可避免DNA降解。
  • 將凝膠在脫嘌呤液中浸泡20min(視靶序列是否大於5kb,若大於則需要此步驟),室溫輕輕晃動至溴酚藍從藍變黃。洗滌一次後在變性液中浸泡30min,再在0.5*變性液中浸泡20min,即可進行Southern轉印。

Southern轉印[編輯]

這裡介紹兩種常用的轉印方法:毛細轉印和電轉印法。

毛細轉印法[編輯]

早期Southern blot是使用毛細轉印法,經虹吸作用,轉移到NC(硝酸纖維)膜上。

  1. 在搪瓷盤中加入300ml 10×SSC,放上培養皿和小玻璃板;
  2. 將3張長濾紙浸濕,逐張放在玻璃板上,用移液管的滾動,趕走氣泡;
  3. 切除多餘凝膠,小心地將凝膠放在濾紙上,趕走濾紙與膠之間的氣泡;
  4. 再將與膠大小相同的尼龍膜放在膠上,同樣不能有氣泡,然後放上三張浸濕的濾紙,趕走氣泡;
  5. 緊貼凝膠四周各放一張X光片;
  6. 小心蒙上一張比搪瓷盤大的保鮮膜。保鮮膜要緊貼濾紙,但不能讓濾紙移動;
  7. 用刀片在離濾紙周圍約1-2 mm處,輕輕割斷保鮮膜,但不能割破濾紙。取走濾紙上的保鮮膜;
  8. 整齊地放上草紙,數張草紙一折二,草紙堆要高出搪瓷盤邊約10cm;
  9. 在草紙上放上玻璃板, 壓上約500g重的重物, 轉移過夜。

電轉印[編輯]

轉印法經過改良後,快速簡便的電轉印法如今應用的更加普遍。

  1. 將膠平放於乾淨投影膠片上;
  2. 裁剪一張與膠同大小的尼龍膜或NC膜,用0.5*TBE浸濕後小心平鋪在膠表面,用玻璃棒除去凝膠和膜之間的氣泡;
  3. 裁剪6張同樣尺寸的濾紙,用0.5*TBE浸濕後平鋪於膜上,用玻璃棒去除氣泡;
  4. 在膠的另一面同樣鋪上6層0.5*TBE浸濕的濾紙,除氣泡;
  5. 將「濾紙-尼龍膜(NC膜)-凝膠-濾紙」轉印裝置移入電轉印儀中,使膜面向陽極,凝膠面向陰極,室溫下,100mA轉印60min。

膜的固定[編輯]

  • 取出膜在2*SSC中浸泡20min。將膜DNA面朝上置於濾紙上,再覆蓋一張濾紙,60℃烤膜30min。

雜交和洗膜[編輯]

  • 將膜放入雜交管內, 加預雜交液, 60℃封閉4-6小時。倒出預雜交液,加雜交液,60℃雜交過夜。再將膜放在洗膜溶液I(2*SSC、0.1%SDS)中,室溫洗2次,每次搖動10min。再在洗膜溶液II(0.5*SSC、0.1%SDS)中漂洗2次, 每次搖動20min。

檢測[編輯]

  1. 將膜在洗膜緩衝液中漂洗3分鐘;
  2. 在封閉緩衝液中室溫搖動封閉30分鐘;
  3. 在抗體溶液中室溫搖動,孵育30分鐘;
  4. 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分鐘;
  5. 將膜與新鮮配製的顯色溶液一起在黑暗中溫育0.5-16小時;
  6. 當條帶顯色到合適的深度後, 或在膜背景變深前, 用TE洗去受質液,乾燥保存。

影響雜交的因素[編輯]

待檢核酸分子的濃度和長度[編輯]

  1. 濃度越大,復性速度越快,敏感性越高;
  2. 分子越大,轉膜越困難,敏感性越低;
  3. 轉膜方法

探針的性質(標記效率、濃度,核酸性質)[編輯]

  1. 對於單鏈探針,濃度越高,雜交率增加;
  2. 探針標記方法和檢測方法的選擇;

雜交液體積、溫度和雜交時間[編輯]

  1. 體積越小,雜交動力學越高;
  2. DNA/DNA雜交適宜的復性溫度為比Tm低20~25℃;
  3. 溫度越低,非特異性越高;溫度越高,敏感性越低;

雜交液的離子強度[編輯]

  1. 低鹽濃度時雜交率較低,隨著鹽濃度增加,雜交率增加(Na+的作用);
  2. 高濃度的鹽使鹼基錯配的雜交體更穩定,當進行序列不完全同源的雜交時,必須維持雜交液與洗膜液中較高的鹽濃度;

非特異性雜交反應[編輯]

雜交前封閉膜上非特異性雜交位點,減少其對探針的非特異吸附。

雜交後的漂洗[編輯]

鹽濃度、溫度、次數、體積

固相膜的選擇[編輯]

陽離子尼龍膜

參見[編輯]

參考書籍[編輯]

  1. Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker著,《BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS》10th ed., Prentice Hall, 2003, ISBN 0-13-066271-2
  2. Leland H.Hartwell, Leroy Hood, Michael L.Goldberg,et al.《Genetics》2nd ed.,Mc Graw Hill Higher Education,2004,ISBN 0-07-246248-5