柱色譜法

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1950年代一名使用柱色譜法的化學家

管柱層析法英語:Column chromatography,又稱為柱層析,俗稱過柱子[1][2])是一種製備性色譜(Preparative chromatography),在化學中是最為常用的從混合物中分離純淨物的分離方法。不同蛋白質具不同大小、電荷、附著力,這些差異可以幫助分離從毫克到公斤級別的產物。柱色譜的主要優點是相對的低成本和可處理的固定相,選用的固定相可以避免重複利用的交叉污染和固定相的分解。

操作[編輯]

用於柱色譜的自動組分收集器及取樣器

常見的製備性色譜柱是直徑5mm至50mm的管狀玻璃儀器,高5mm至1m,底部有旋塞,柱體底部間通常塞有多孔玻璃塊或玻璃纖維以支撐填料。色譜柱的裝填主要有兩種方法:

  • 干法裝填。首先往柱體裝入乾燥的固定相粉末,然後自頂部加入流動相溶劑,沖洗直至整個固定相被溶劑浸沒。
  • 濕法裝填。首先將固定相和流動相溶劑混合製成懸濁液,關閉色譜柱旋塞,柱體豎直,均勻地將懸濁液倒入,注意不能產生氣泡。傾倒最好一次完成,否則固定相間斷層影響分離效果。等待片刻,固定相沉降,有時用塑膠球輕敲柱體幫助固定相堆積密實。裝填完成後頂端自然留有一段溶劑。

固定相裝填完畢後,通常在其頂端鋪上一小層硅藻土玻璃纖維棉花等材料,用來保護固定相頂層的形狀不被流體攪亂。將液面調節至固定相頂端以上,硅藻土頂端附近,小心滴加含有待分離物質的溶液。溶劑自柱色譜上口補充,同時打開下旋鈕開始洗脫。分離過程中必須保持液面在固定相頂端以上,否則將會出現氣泡和裂縫。[3]如果發生干柱,吸附在固定相中的產物可能很難沖洗下來,需拆下使用溶劑溶解,造成時間上的消耗和產物上的損失。由於分離時間通常較長,有時在柱頂加上一溶劑球,或裝滿溶劑的分液漏斗,以保持液面可以持續高於柱頂一段時間,而不必一直在旁值守。

使用一系列按次序編號的錐形瓶或試管等接收溶劑,由於各組分通過固定相速度的差異,流出時間有差別,於是不同組分被分離到不同編號的容器中。通過旋轉蒸發等手段濃縮產物。並且,較長時間的柱色譜分離可能耗費大量溶劑,旋蒸過後的溶劑可拿來重複使用。

對於有色物質的分離,可通過流出序列顏色判斷產物位置,[4]然而,多數情況需要藉助分析性色譜的方法判斷。常用的方法例如取一組流出液點板,進行薄層色譜分析,矽膠板置於紫外燈下,從產物螢光判斷組分。

柱色譜法的分離步驟

可同時操作數根色譜柱以提高分離效率,多通道收集器可實現區分不同組分的流出液,其原理是通過紫外-可見分光光度法螢光光譜監控流出液的組分。已有快速製備色譜儀實現自動化的分離和組分檢測。[2]

固定相[編輯]

固定相通常為吸附性的粉末狀固體。最常用的固定相是矽膠,其次是氧化鋁。過去也有使用纖維素的。除此之外,離子交換色譜法英語ion exchange chromatography反相色譜法親和色譜法擴張床吸附英語expanded bed adsorption也可用於柱色譜。固定相與待分離物質乾重之比是一個評估固定相效率的重要參數,對於矽膠,這一比值在20:1到100:1之間,取決於待分離物保留因子的接近程度。[5]

流動相[編輯]

流動相或稱洗脫劑,可以是單組份的純溶劑,但更多情況下選用一定比例的混合溶劑。流動相的選擇對柱色譜分離至關重要。溶劑配比或根據文獻,自己嘗試時則需綜合考慮產物和溶劑極性等因素。極性產物能被極性溶劑洗脫,而非極性產物能被非極性溶劑洗脫。[3]常使用薄層色譜法(TLC)測試各組分的保留因子,以確定固定相溶劑種類和配比。通常,保留因子在0.2至0.3之間較為合適,平衡了分離效率和溶劑消耗量。

流動相的流出速率影響分離的效果。較快的速率能縮短實驗時間,並且減少擴散,因而使得分離效果更好。然而流速也不是越快越好,因為固定相和流動相之間平衡需要時間。范第姆特方程對影響分離效果幾種主要因素進行了總結,根據此方程,流速當有一最優值。簡單的柱色譜利用重力驅動洗脫,調節旋鈕減慢流速,或者在柱頂加上溶劑球增加壓力加快流速。需要更快的流速時,可使柱頂與泵或壓縮氣體(例如空氣、氮、氬)相通,在液面以上加壓,這種方法稱為快速柱色譜(flash column chromatography)。[6][7]

快速柱層析中的固定相粒徑一般比普通的小。前者最常用的粒徑為230 – 400 (40 – 63 µm),而後者通常為70 – 230目(63 – 200 µm)。[8]

自動化系統[編輯]

一台自動化離子色譜儀

柱色譜是化學實驗室中極為耗時的步驟,以至於成為實驗室工作的效率瓶頸。基於此現狀,很多實驗室儀器製造商,包括Biotage、Buchi、Interchim和Teledyne Isco等公司已經開發了自動化的快速柱色譜系統,稱為LPLC(low pressure liquid chromatography,低壓液相色譜儀,工作壓力350~525 kPa或50.8~76.1 psi),以期人力投入的最小化。LPLC通常含有更昂貴的高效液相色譜(HPLC)的組件,包括梯度泵,樣品注入埠,UV檢測器和餾分收集器。LPLC可分離毫克至千克級的產物,對於原本需要HPLC多次進樣的情況提供更廉價的解決方案。

參考資料[編輯]

  1. ^ 過柱子是什麼意思?柱子乾了為什麼可怕?. 網易新聞中心. 2015-07-20 [2017-01-29]. 
  2. ^ 2.0 2.1 上海科技大學自動過柱機(自動純化系統)中標公告. 中國政府採購網. 2016-09-28 [2017-01-29]. 
  3. ^ 3.0 3.1 關燁第. 有機化學實驗 第二版. 北京大學出版社. 2002年10月. ISBN 7301058594. 
  4. ^ 江洪. 基礎有機化學實驗. 科學出版社. 2015年7月: 74. ISBN 9787030449870. 
  5. ^ Setting up a flash chromatography column
  6. ^ Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041)
  7. ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice Illustrated. 13 Jun 1989: 180–185. ISBN 978-0-632-02017-1. 
  8. ^ Normal phase column chromatography, Material Harvest