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分子克隆（Molecular Cloning）是一种分子生物学的常用技术。分子克隆的克隆字面意思是“复制”，在分子克隆中专指产生一群含有目的载体的宿主细胞[1]。
分子克隆可分为两个主要步骤：先构建重组DNA（即目的载体。重组意指DNA分子的拥有来源不同的几个部分），再利用宿主细胞对构建的载体进行复制。分子克隆中最常用的载体和宿主细胞分别是质粒（plasmid）以及大肠杆菌（E. coli）。该技术路线操作简便，且细菌繁殖极快，可以在短期内收获大量重组DNA分子。理论上，该路线仅需要不到一周时间就可以完成。但质粒和大肠杆菌的组合也存在一定的局限性。比如，质粒一般来说只能允许10kb以下的目的片段插入，因而根据情况可能需要使用λ噬菌体、黏粒、酵母人工染色体（YAC）等载体[2]。
分子克隆是基因工程的重要一环，在生命科学研究中具有重要地位，许多研究在不使用分子克隆技术将难以进行。分子克隆是RNA干扰、基因敲除/敲入、基因编辑等技术的基础。除了用于基础研究外，生产重组蛋白、构建转基因生物、实行基因治疗也需要用到分子克隆技术。另外，在农业、法医、考古等领域，分子克隆也扮演着重要的角色。
经典的分子克隆[编辑]
经典的分子克隆使用质粒作为载体，大肠杆菌作为宿主细胞。利用该路线，研究者可以在短期内获得大量的载体：对几个菌落或者几毫升的菌液进行质粒小提一般可以获得几微克或几十微克的质粒，而对数百毫升的菌液进行质粒中提或大提可以获得毫克级的质粒。
载体的选择[编辑]
在进行分子克隆前，选择合适的载体是十分必要的。首先，选择的载体应该满足后续实验的需求。质粒载体需要能在大肠杆菌体内进行自我复制，并含有可以对其进行筛选的基因或标记（如中间插入了多酶切位点的lacZ基因或抗生素抗性基因等）。[3]:379。如果是对一个基因进行研究，那么该基因的插入位点应该置于一个启动子的控制之下。这个启动子在后续载体会转入的宿主（如植物细胞或哺乳动物细胞）中要是可用的[4]:237-239。从结构上说，质粒载体的大小首先应适中，太长或太短都会使得实验变得困难。另外，目的片段的插入位点应该有合适的酶切位点。一般从生物技术公司或其他途径得到的质粒，在插入位点都会有一段拥有多个酶切位点的片段（称为多酶切位点片段（MCS））[3]:379。虽然现今已有反向PCR等特殊的方法将片段插入到载体上无合适酶切位点的位置，但实验过程将会因此变得麻烦许多[5]。
质粒载体的命名通常是小写的“p”+实验室代号+编号，例如最早构建的质粒载体pBR322即表示由代号BR的实验室构建的序号为322的质粒载体。pBR322长4361bp，是一种带有Amp（氨苄霉素）以及Tet（四环素）抗性的质粒载体，当片段插入抗性基因中央时，携带该质粒的细菌会失去对该抗生素的抗性，进而可以对含有目的片段的载体进行筛选[6]。除pBR322外，一些较为常用的载体还有能进行蓝白斑筛选的pUC8、含有强启动子T7的原核表达质粒pET28（同样能进行蓝白斑筛选）等等[7]。
质粒本身有一定的局限性。比如，目的片段的长度如果大于10kb（千碱基对），则应该考虑换用噬菌体或黏粒（cosmid）等容量更大的载体[1]。
目的片段的选择与获取[编辑]
通常来说，目的片段（insert）是一个基因或者一个转录盒的cDNA。但目的片段亦可以是待研究的启动子等[1]。目前，较为常用的获取目的片段的方法是使用高保证的Taq酶对该物种的基因组DNA进行PCR（注意务必应使用经过改造的高保真酶，因为Taq酶错配率较高，将导致插入片段中大概率含有单碱基突变[3]:164-165）。如果已经对待研究的物种完成了测序，而且已确定待研究的基因或启动子，只需要搜寻该片段及周围区域的序列，然后设计特异性的引物即可[3]:157-159[8]。但如果尚未确认需要研究的目的片段，则需要先使用定位克隆等基因筛选技术确定需要研究的片段[9]。
除此之外，还可以使用酶切或反转录的方法先构建基因组文库（Genome Library）或cDNA文库（cDNA Library）。如果该基因与某些抗生素基因或营养素合成基因相邻，那么带有含该段插入序列的质粒的细菌可以在某种特定培养基中生长，而其他细菌则会在培养过程中死亡。利用上述原理，可以筛选出含有这类目的片段的载体，对含有目的质粒载体的菌体进行扩增培养。另外，还可以设计特异性探针，利用杂交探针技术鉴定出所需的菌落，然后进行培养扩增。当上述步骤完成后，就可以直接进入分离提取步骤[3]{{rp|134-152}
亚克隆[编辑]
亚克隆是指将目的片段与载体连接的过程。目前，亚克隆的传统方法是通过PCR及限制酶处理实现。另外，新出现的In-fusion技术的应用面也越来越广。
如果目的片段两端所具有的酶切位点与载体预期插入位点上的酶切位点相同，且预期不会产生不需要的副产物，那么就可以分别对含有目的片段的DNA和载体进行酶切。酶切选用单酶切还是双酶切需要根据实际情况而定。如果目的片段两段的酶切位点是相同的，那么可以选用单酶切。选用单酶切时，载体也只会出现一个切口。单酶切的不足之处是，在后续的连接操作中，载体和目的片段容易发生自连，最后得到的连接产物可能是两个载体自连产生的环状DNA或接有两个以上目的片段的目的载体。不过，使用磷酸酶可以降低载体自连。双酶切法可以有效防止载体自连或目的片段自连，但不足之处又在于操作复杂，且对载体和。用琼脂糖凝胶电泳分离出不同大小的片段，再通过胶回收
载体的引入及克隆[编辑]
载体的分离提取[编辑]
在得到大量含有目的质粒的细菌后，下一步需要考虑的问题是如何将质粒自这些细菌中分离提取，即如何提取质粒。虽然目前通行的质粒提取方法
其他的分子克隆载体[编辑]
使用分子克隆技术的研究[编辑]
实际应用[编辑]
参见[编辑]
参考[编辑]
- ^ 1.0 1.1 1.2 Jocelyn E. Krebs; et al. Genes XI. JONES&BARTLETT LEARNING. 2014: 46–51. ISBN 978-7-04-039649-2.
- ^ Garret, Grisham. Biochemistry. Belmont, CA, Brooks/Cole,: Cengage Learning. 2010: 380.
- ^ 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer. ESSENTIALS OF GENETICS (Six Edition). 北京: 高等教育出版社. 2007.
- ^ T.A. Brown原著，魏群等译. 基因克隆和DNA分析（Gene Cloning and DNA Analysis）第五版. 北京: 高等教育出版社. 2006. ISBN 978-7-04-022085-8.
- ^ Malathi Raman, Karen Martin. One solution for cloning and mutagenesis: In-Fusion® HD Cloning Plus. Nature Methods 11 (2014).
- ^ Watson, N. A new revision of the sequence of plasmid pBR322. Gene. 1988, 70 (2): 399–403. PMID 3063608. doi:10.1016/0378-1119(88)90212-0.
- ^ pET28a. Havard University Medical School. [2017-07-17]. （原始内容存档于2017-07-17）.
- ^ Plasmid Cloning by PCR. Addgene. [2017-07-17]. （原始内容存档于2017-07-17）.
- ^ Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM, Veres RC. Genetics: from genes to genomes. Boston: McGraw-Hill Higher Education. 2008. ISBN 0-07-284846-4.