革蘭氏染色

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經革蘭氏染色的炭疽桿菌(圖中藍紫色棒狀)

革蘭氏染色是用來鑒别細菌的一種方法,細菌細胞壁上的主要成份不同,利用這種染色法,可將細菌分成兩大類,即革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌。這種染色法是由一位丹麥醫生漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram,1853年-1938年)於1884年所發明,最初是用來鑑別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關係。

革蘭氏染色的对象是细菌细胞壁。染色后的细菌可在显微镜下更好的观察,以便于区分。

不同的细菌在该染色法的作用底下反应不同,借以区分成为两类:

  • 革蘭氏阳性细菌,胞壁染色后呈蓝紫色
  • 革蘭氏阴性细菌,染色后呈红色

这是辨别细菌种类的一个重要特性,对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗很有帮助。

革蘭氏阳性细菌和革蘭氏阴性细菌对抗生素的反应并不一样。通过抽取样品医生可以在很短的时间内(5分钟左右)确定细菌的革蘭氏性质。这样,医生就可以迅速的给病人注射抗生素,而不需要等待通过细菌培植得到的化验结果,这往往需要几天时间。

染色流程及原理[编辑]

流程可概括为:染色-脱色-复染。

  • 第一步初染剂(Primary Stain):使用结晶紫染色。
  • 第二步媒染劑(Mordant)

加入複方碘溶液或稱革蘭氏碘液(Gram's Iodine)後會形成不溶性的結晶紫-碘(CV-I)複合体。細菌呈紫黑色。第二步是關键,它的目的是分辨细菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌,此複合體係結合於細胞壁之鎂、核糖核酸(Magnesium Ribonucletic Acid),形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘(Mg-RNA-CV-I)複合體,不易脫去。

  • 第三步脫色劑(Decoloring Agent)

使用酒精(95%)脱色,試劑具脂溶劑(Lipid Solvent)和蛋白脫水劑(Protein Dehydrating Agent)之雙重功能。此步驟對革蘭氏陽性細菌無效,因為細胞壁上厚厚的細胞壁層阻隔了結晶紫-碘複合體的外渗,只能留在细菌体内。革蘭氏陰性菌細胞壁層薄,會被脱色而成為無色。

  • 第四步複染劑(Counterstain)

為了對比,在此之後会加入番红(Safranin)進行複染,革蘭氏阴性菌成红色,而革蘭氏阳性菌仍保有原來的紫色。

定性[编辑]

KOH-试验[编辑]

另外的一种方法是氢氧化鉀-试验。将培养好的细菌取出一小部分,使其悬浮于一滴KOH溶液中。革蘭氏阳性菌与之不发生反应,用细针穿过该溶液,溶液呈正常液体状。革蘭氏陰性菌因細胞壁中主要成分為脂多醣,脂質含量較高,接觸強鹼KOH後與KOH發生皂化反應,以細針穿過會有明顯黏稠狀

氨肽酶试验[编辑]

除了个别例外,只有革蘭氏阴性菌才能证明氨肽酶的存在。这是该试验的基础。 将要进行试验的细菌放入试管加水。放入一张显示肽酶活性的试纸,在37°C下等待10到35分钟,试纸变成深黄色。

實驗方法[编辑]

藥品[编辑]

  1. 結晶紫:作為初染劑
  2. 碘液:作為媒染劑
  3. 酒精:濃度為95%,作為脫色劑
  4. 番紅:複染劑

實驗器材[编辑]

實驗菌種、接種環、蒸餾水、玻片、酒精燈、吸水紙、顯微鏡

實驗步驟[编辑]

  1. 將菌種抹於玻片上,並置於酒精燈上加以熱固定。
  2. 將結晶紫滴於玻片上,靜置一分鐘後用蒸餾水洗去多餘的結晶紫。
  3. 將碘液滴於玻片上,靜置一分鐘後,用蒸餾水洗去多餘的碘液。
  4. 酒精脫色,直至無結晶紫的顏色流出為止。
  5. 以番紅複染,約45秒後用蒸餾水洗去。
  6. 用吸水纸將多餘的水吸乾後,即可置於顯微鏡下觀察。

注意事項:

  • 以酒精燈烘乾玻片時,應避免熱源持續對同一點加熱,以免玻片破掉。
  • 以蒸餾水洗去多餘藥品時,應避免直接沖洗到樣品的位置,可將玻片與水平面呈一個角度,使蒸餾水由玻片較高處往樣品處流去。
  • 此實驗的標準作法應於無菌的狀態下操作。
  • 本實驗可以大腸桿菌和金黃葡萄球菌作為控制組。

實驗結果[编辑]

大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)染色結果
金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)染色結果

参考文献[编辑]