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酶谱法

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诺氏疟原虫天冬酰胺内肽酶印记.[1]

酶谱法酶谱英语:Zymography)是一种基于的底物库来检测水解酶凝胶电泳技术。使用三种类型的酶谱法;凝胶酶谱法原位酶谱法体内酶谱法中。[2]例如,嵌入聚丙烯酰胺凝胶中的明胶将被凝胶中运行的活性明胶酶消化。考马斯亮蓝染色后,退化区域在深色染色背景下显示为清晰的条带。[3]

酶谱一词的现代用法已经被用来定义发酵产品的研究和编目,例如啤酒葡萄酒,通常由特定的酿酒师或在确定的发酵类别中进行,例如使用特定的酵母菌株或细菌种类。酶谱也指相关的发酵产品的集合,被视为一个作品集。例如,特定啤酒厂生产的所有啤酒都可以统称为其酶谱。

另见酶学(又称酶谱应用科学)。酶学涉及发酵的生化过程,特别是酿造、酿酒和其他发酵食品中发酵酵母和细菌的选择。例如,啤酒酿造涉及应用顶部(淡啤酒)或底部发酵酵母(啤酒),以生产所需的各种啤酒。酵母的合成会影响啤酒的风味特征,即双乙酰(黄油、奶油糖果的味道或香气)。

凝胶酶谱法

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用于SDS-PAGE的样品将在标准非还原加载缓冲液中制备。在这过程中不需要还原剂或将其煮沸,因为它们会干扰酶的重新折叠。在丙烯酰胺凝胶的制备过程中,将合适的底物(例如用于蛋白酶检测的明胶酪蛋白)包埋在分离胶中。电泳后,通过在未缓冲的曲拉通X-100中孵育从而将凝胶(或酶谱)中的十二烷基硫酸钠去除,然后在适当的消化缓冲液中孵育,以便在37°C下的最佳时间长度孵育。随后对酶谱进行染色(通常使用氨基黑10B考马斯亮蓝),消化区域显示为清晰的条带,而底物已被酶降解的则呈现深色染色背景。

标准协议的变体

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标准方案可能需要根据样品酶进行修改;例如,黑腹果蝇消化糖苷酶通常在还原条件下(即存在2-巯基乙醇二硫苏糖醇)以及在一定程度上加热条件下存活。事实上,加热到50°C后的分离往往会表现出条带分辨率的显着增加,而没有明显的活性损失。[4][5]

过去用于α-淀粉酶活性酶谱分析的常用方案也就是所谓的W.W.多恩淀粉膜方案。这里运行天然PAGE凝胶以分离匀浆中的蛋白质。随后,将其中溶解(或更准确地说,悬浮)淀粉的薄凝胶覆盖在原始凝胶上一段时间。[6]然后用卢戈氏碘液淀粉染色。

凝胶酶谱通常用于检测和分析微生物产生的酶。[7]这导致了标准协议的变化,例如混合底物酶谱法。[8]

反向酶谱将底物和酶与丙烯酰胺共聚,可用于证明酶抑制剂的活性。染色后,抑制区域可视化为透明(或轻微染色)背景下的暗条带。

在印记技术中,酶通过非变性凝胶电泳分离,凝胶置于底物处理过的洋菜上。[9]

酶谱法也可应用于其他类型的酶,包括木聚糖酶脂肪酶几丁质酶

参见

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参考资料

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  1. ^ Hempelmann, E.; Putfarken, B.; Rangachari, K.; Wilson, R.J.M. Immunoprecipitation of malarial acid endopeptidase. Parasitology. 1986, 92 (2): 305–312. PMID 3520446. doi:10.1017/S0031182000064076. 
  2. ^ Vandooren J, Geurts N, Martens E, Van den Steen PE, Opdenakker G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nat Methods. 2013, 10 (3): 211–220. PMID 23443633. S2CID 5314901. doi:10.1038/nmeth.2371. 
  3. ^ Gelatin zymography protocol | Abcam. www.abcam.com. [2017-05-12]. (原始内容存档于2023-02-22) (英语). 
  4. ^ Martínez TF, Alarcón FJ, Díaz-López M, Moyano FJ. Improved detection of amylase activity by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis with copolymerized starch.. Electrophoresis. 2000, 21 (14): 2940–2943. PMID 11001307. doi:10.1002/1522-2683(20000801)21:14<2940::AID-ELPS2940>3.0.CO;2-S. 
  5. ^ Snoek-van Beurden PA, Von den Hoff JW. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 2005, 38 (1): 73–83. PMID 15679089. doi:10.2144/05381RV01可免费查阅. 
  6. ^ Doane WW. Amylase variants in Drosophila melanogaster: linkage studies and characterization of enzyme extracts. J Exp Zool. 1969, 171 (3): 31–41. PMID 5348624. doi:10.1002/jez.1401710308. 
  7. ^ Lantz MS, Ciborowski P. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases.需要免费注册. Methods Enzymol. Methods in Enzymology. 1994, 235: 563–594. ISBN 9780121821364. PMID 8057927. doi:10.1016/0076-6879(94)35171-6. 
  8. ^ 引用错误:没有为名为vandoorenetal2的参考文献提供内容
  9. ^ 引用错误:没有为名为Hempelmann2的参考文献提供内容