线性二色性

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线性二色性英语Linear dichroism,简称LD)是主要用于研究分子功能和结构的光谱技术。LD可以通过平行或垂直于一个取向方向轴的光吸收的差异测得[1]。LD的测量基于光和物质之间的相互作用,是电磁光谱的一种形式,如今主要应用在研究生物高分子(如DNA)及人工合成的聚合物方面。

基本原理[编辑]

线性偏振

LD是使用线性偏振光,即被偏振极化)仅在一个方向上波动的光。光产生的波由仅在一个面内振动的电场向量,使光以典型的正弦曲线形式传播通过空间。通过使用平行和垂直于分子取向方向的偏振光,可以测量某一个一维的分子相对于其他分子多吸收了多少能量,为实验主义者提供了信息。

已知光和分子的相互作用,当分子开始吸收光,由于电子被光子激发,能级升高,进入分子的光强将发生变化。这个电子变化称为电子跃迁,其方向称为电子跃迁极化。LD测量正是依据这个性质。

一个取向分子的LD值可以被下列等式计算: LD = A║- A┴ A║是平行于取向轴的光吸收,A┴ 是垂直于取向轴的光吸收。

注意,任何波长的光可被用于产生LD信号。

LD信号因此有两个极限。对于一个电子跃迁方向平行于取向轴的化学系统,可写作下式:

LD = A║- A┴ = A║ > 0

对大部分化学系统这代表电跃迁极化顺着分子的长度(即,平行于取向轴)。

或者,电子跃迁极化可被视为完全垂直于分子的取向,给出下式:

LD = A║- A┴ = - A┴ < 0

这个等式代表记录到的LD信号是电跃迁极化顺着分子的宽度(即,垂直于取向轴),是两个轴中较小的一个。

因而,LD可用在两个方面。如果已知分子在流动中的取向,实验者可观测分子极化(偏振化)的方向,进而考虑分子的化学结构;或者如果极化方向是已知的,则可用来测定分子在流动中的取向。

对大分子而言,一些定性的信息如发色基在空间中如何取向可以通过LD信号简单的获得。而分子取向多数情况下遵循这样一个定量的描述:

LD^r=\frac{LD}{A}=\frac{A\rVert-A\bot}{A}=\frac{3}{2}S(3cos^2\alpha-1)

这里LDr是 所谓的简化LD。S是一个比例常数(取向因子),对完美取向来说S=1,对随机取向来说S=0,决定了宏观取向的效率。α是特定波长吸 收光产生 的跃迁矩和参考系坐标轴的夹角(如果有在同一波长有多个跃迁吸收那么取平均值)。A是在各项同性溶液中的吸收度,即无定向条件下。注意,A,A║,A┴和 LD一样有相同的浓度c和厚度l。因此我们不需要知道样品的浓度和厚度。

此方程表明在任何取向系统,跃迁矩和参考坐标轴有夹角α,则在以轴为中心形成的圆锥上的可能性相等。例如发色团沿着一个螺旋结构存在。

若样品满足宏观上单轴的条件,如在聚合物薄膜上向一个方向拉伸或者存在于电场中的极性分子,A║,A┴和A有一个简单的关系使得不需要同时测定这三个量。

A=1/3(A║+ 2A┴)

紫外线二色光谱[编辑]

UV LD

有一部分生物分子,特别是大型的,易弯曲的,长的分子,通过如NMR和X光衍射法较难判定结构。UV LD(200-400nm)是应用于分析此类分子的代表性方法。尤其是测定DNA构型和药物-DNA系统的几何键合情况。

测定DNA的基本理论[编辑]

DNA非常适合于UV LD测定,分子很长且薄,使得它很容易在流动中取向,产生强烈的LD信号。用UV LD测定的DNA系统包括DNA-酶复合物和DNA-配体复合物[2],后者的构成易通过动力学实验观察。

核酸吸收和LD谱容易在UV区(最小到180-190nm)处测得,这是被嘌呤和嘧啶的π→π*所控制,此跃迁均于碱基平面内极化。

DNA配体键合[编辑]

一 旦明白了DNA自身取向,下一步就是运用LD来探测DNA和小配体分子的键合和取向情况。一个关键的LD研究特性是如果没有明确的键合,就没有配体跃迁的 LD。相反,假象的配体LD信号从吸收带中的消失证实了配体的键合。尽管LD不能告诉我们配体在何处和DNA键合,但它可用来测定配体的取向(如果配体跃 迁矩已知)。这经常给键合模式提供有意义的线索。配体和DNA的键合可以以多种形式,包括对序列和取向的考虑。一般而言以以下几种形式:

  • 外部:键合在磷酸骨架上:这种模式的取向是不确定的而且引起的LD(和CD)信号很小。
  • 夹层:键合在DNA碱基之间:这种模式需要平面状分子,DNA链解开,在临近的碱基对之间打开一个口子,配体像三明治一样的夹在其中。
  • 在小槽中:这种模式被芳香型分子经常采用,包括有一定旋转自由度的核内键合。例如,长分子如纺锤菌素,偏段霉素,烟酸已可碱33258和DAPI(4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸),可以顺着槽的曲率紧密结合在小槽内,太大而不能夹层的分子更喜欢这种键合模式。这些分子的长轴和DNA螺旋轴夹角α=45°,短轴与螺旋轴垂直(平行于碱基对)。
  • 在大槽中:这种键合模式在多种调整蛋白中被发现,大槽有足够的空间使小配体分子在其中有多种取向。

LD较多应用在上述的第2,3种情况中。实际实验中,通常使用ct-DNA,A-T碱基聚合物,G-C碱基聚合物。分别测定ct-DNA的LDr,ct-DNA和配体混合后的的LDr,(A-T)n和配体混合后的LDr值,及(G-C)n和配体混合后的LDr值。通过纯DNA的LDr,代入公式求出S(其中α=90°,即碱基对与螺旋轴的夹角),再分别由三种混合物的LDr值,代入S,求得α,通过夹角判定键合模式。


多肽[编辑]

典型的多肽吸收光谱在180-240nm区域内显示由三种电子跃迁决定的特征:酰胺残基在200nm周围的两个从π到π*的强烈激发跃迁矩,和一个220nm周围从n到π*的弱激发跃迁矩。对α螺旋的多肽来说,一个组分(210nm)顺着螺旋轴方向,另一个(190nm)垂直于螺旋轴。如果n→π*跃迁是由于一个只包含碳的发色基,它的偶极矩变化为0。对多肽来说,酰胺发色基的不对称性导致了π轨道的偶合,跃迁需要一些电特性和每个残基上的电子跃迁偶极矩。

可以通过拉伸在二氧化硅面上的潮湿薄膜定向聚L-谷氨酸并测定A║和A┴。A║指偏振光平行于薄膜拉展方向,这个方向可能和细丝状的α螺旋多肽分子更倾向的取向方向相同(螺旋轴)。

校准方法[编辑]

即将分子排布方向保持一致的方法

库埃特流

库埃特流取向系统是应用最广泛的UV LD样品取向方法,是现在仅有的确立溶液相中平均分子取向的方法。此方法只需要极少量的样品(20-40微升)用于分析LD光谱。系统的另一个优点是对样品的循环使用,允许对每个样品的重复测定,减少了最终录得谱的背景噪声影响。

它的操作模式非常简单,将样品放在一个旋转的管和一个固定棒之间。样品在管中不断旋转,光束照射通过样品,从水平偏振光计算得平行吸收,从垂直偏振光计算得垂直吸收。库埃特流UV LD是现在唯一商业上适用的平均LD取向方法

拉伸薄膜

拉伸薄膜线二色性谱是基于合并样品分子和聚乙烯薄膜[3]的取向方法。拉伸聚乙烯薄膜导致原本随机取向的分子'跟随'薄膜的运动。薄膜的拉伸导致样品分子和拉伸方向取向一致。

相关技术[编辑]

参考书目[编辑]

  1. ^ Alison Rodger and Bengt Nordén, Circular Dichroism and Linear Dichroism (1997) Oxford University Press, Oxford, UK. ISBN 019855897X.
  2. ^ Hannon, M.J., Moreno, V., Prieto, M.J., Molderheim, E., Sletten, E., Meistermann, I., Isaac, C.J., Sanders, K.J., Rodger, A. “Intramolecular DNA coiling mediated by a metallo supramolecular cylinder” Angewandte Chemie, 2001, 40, 879−884
  3. ^ Heinz Falk, Gunther Vormayr, Leon Margulies, Stephanie Metz and Yehuda Mazur ‘A Linear Dichroism Study of Pyrromethene-, Pyrromethenone- and Bilatriene-abc-Derivates’ 1986, Monatshefte fur Chemie, 117 : 849-858.