線性二色性

線性二色性（英語：Linear dichroism，簡稱LD）是主要用於研究分子功能和結構的光譜技術。LD可以通過平行或垂直於一個取向方向軸的光吸收的差異測得^[1]。LD的測量基於光和物質之間的相互作用，是電磁光譜的一種形式，如今主要應用在研究生物高分子（如DNA）及人工合成的聚合物方面。

基本原理[編輯]

線性偏振

LD是使用線性偏振光，即被偏振（極化）僅在一個方向上波動的光。光產生的波由僅在一個面內振動的電場向量，使光以典型的正弦曲線形式傳播通過空間。通過使用平行和垂直於分子取向方向的偏振光，可以測量某一個一維的分子相對於其他分子多吸收了多少能量，為實驗主義者提供了信息。

已知光和分子的相互作用，當分子開始吸收光，由於電子被光子激發，能級升高，進入分子的光強將發生變化。這個電子變化稱為電子躍遷，其方向稱為電子躍遷極化。LD測量正是依據這個性質。

一個取向分子的LD值可以被下列等式計算： LD = A║- A┴ ， A║是平行於取向軸的光吸收，A┴ 是垂直於取向軸的光吸收。

注意：任何波長的光可被用於產生LD信號。

LD信號因此有兩個極限。對於一個電子躍遷方向平行於取向軸的化學系統，可寫作下式：

LD = A║- A┴ = A║ > 0

對大部分化學系統這代表電躍遷極化順著分子的長度（即，平行於取向軸）。

或者，電子躍遷極化可被視為完全垂直於分子的取向，給出下式：

LD = A║- A┴ = - A┴ < 0

這個等式代表記錄到的LD信號是電躍遷極化順著分子的寬度（即，垂直於取向軸），是兩個軸中較小的一個。

因而，LD可用在兩個方面。如果已知分子在流動中的取向，實驗者可觀測分子極化（偏振化）的方向，進而考慮分子的化學結構；或者如果極化方向是已知的，則可用來測定分子在流動中的取向。

對大分子而言，一些定性的信息如發色基在空間中如何取向可以通過LD信號簡單的獲得。而分子取向多數情況下遵循這樣一個定量的描述：

LD^{r}={\frac {LD}{A}}={\frac {A\rVert -A\bot }{A}}={\frac {3}{2}}S(3cos^{2}\alpha -1)

這裡LD^r是所謂的簡化LD。S是一個比例常數（取向因子），對完美取向來說S=1，對隨機取向來說S=0，決定了宏觀取向的效率。α是特定波長吸收光產生的躍遷矩和參考系坐標軸的夾角（如果有在同一波長有多個躍遷吸收那麼取平均值）。A是在各項同性溶液中的吸收度，即無定向條件下。注意：A、A║、A┴和 LD一樣有相同的濃度c和厚度l。因此我們不需要知道樣品的濃度和厚度。

此方程表明在任何取向系統，躍遷矩和參考坐標軸有夾角α，則在以軸為中心形成圓錐上的可能性相等。例如發色團沿著一個螺旋結構存在。

若樣品滿足宏觀上單軸的條件，如在聚合物薄膜上向一個方向拉伸或者存在於電場中的極性分子，A║、A┴和A有一個簡單的關係，使得不需要同時測定這三個量。

A=1/3(A║+ 2A┴)

紫外線二色光譜[編輯]

UV LD

有一部分生物分子，特別是大型的，易彎曲的，長的分子，通過如NMR和X光衍射法較難判定結構。UV LD（200-400nm）是應用於分析此類分子的代表性方法。尤其是測定DNA構型和藥物-DNA系統的幾何鍵合情況。

測定DNA的基本理論[編輯]

DNA非常適合於UV LD測定，分子很長且薄，使得它很容易在流動中取向，產生強烈的LD信號。用UV LD測定的DNA系統包括DNA-酶複合物和DNA-配體複合物^[2]，後者的構成易通過動力學實驗觀察。

核酸吸收和LD譜容易在UV區（最小到180-190nm）處測得，這是被嘌呤和嘧啶的π→π^*所控制，此躍遷均於鹼基平面內極化。

DNA配體鍵合[編輯]

一旦明白了DNA自身取向，下一步就是運用LD來探測DNA和小配體分子的鍵合和取向情況。一個關鍵的LD研究特性是如果沒有明確的鍵合，就沒有配體躍遷的 LD。相反，假象的配體LD信號從吸收帶中的消失證實了配體的鍵合。儘管LD不能告訴我們配體在何處和DNA鍵合，但它可用來測定配體的取向（如果配體躍遷矩已知）。這經常給鍵合模式提供有意義的線索。配體和DNA的鍵合可以以多種形式，包括對序列和取向的考慮。一般而言以以下幾種形式：

外部：鍵合在磷酸骨架上：這種模式的取向是不確定的而且引起的LD（和CD）信號很小。
夾層：鍵合在DNA鹼基之間：這種模式需要平面狀分子，DNA鏈解開，在臨近的鹼基對之間打開一個口子，配體像三明治一樣的夾在其中。
在小槽中：這種模式被芳香型分子經常採用，包括有一定旋轉自由度的核內鍵合。例如，長分子如紡錘菌素，偏段黴素，煙酸已可鹼33258和DAPI（4',6二脒基-2-苯吲哚鹽酸),可以順著槽的曲率緊密結合在小槽內，太大而不能夾層的分子更喜歡這種鍵合模式。這些分子的長軸和DNA螺旋軸夾角α=45°，短軸與螺旋軸垂直（平行於鹼基對）。
在大槽中：這種鍵合模式在多種調整蛋白中被發現，大槽有足夠的空間使小配體分子在其中有多種取向。

LD較多應用在上述的第2，3種情況中。實際實驗中，通常使用ct-DNA，A-T鹼基聚合物，G-C鹼基聚合物。分別測定ct-DNA的LD^r，ct-DNA和配體混合後的的LD^r,(A-T)_n和配體混合後的LD^r值，及(G-C)_n和配體混合後的LD^r值。通過純DNA的LD^r，代入公式求出S（其中α=90°，即鹼基對與螺旋軸的夾角），再分別由三種混合物的LD^r值，代入S，求得α，通過夾角判定鍵合模式。

多肽[編輯]

典型的多肽吸收光譜在180-240nm區域內顯示由三種電子躍遷決定的特徵：醯胺殘基在200nm周圍的兩個從π到π*的強烈激發躍遷矩，和一個220nm周圍從n到π*的弱激發躍遷矩。對α螺旋的多肽來說，一個組分（210nm）順著螺旋軸方向，另一個（190nm）垂直於螺旋軸。如果n→π*躍遷是由於一個只包含碳的發色基，它的偶極矩變化為0。對多肽來說，醯胺發色基的不對稱性導致了π軌道的偶合，躍遷需要一些電特性和每個殘基上的電子躍遷偶極矩。

可以通過拉伸在二氧化矽面上的潮濕薄膜定向聚L-穀氨酸並測定A║和A┴。A║指偏振光平行於薄膜拉展方向，這個方向可能和細絲狀的α螺旋多肽分子更傾向的取向方向相同（螺旋軸）。

校準方法[編輯]

即將分子排布方向保持一致的方法

庫埃特流

庫埃特流取向系統是應用最廣泛的UV LD樣品取向方法，是現在僅有的確立溶液相中平均分子取向的方法。此方法只需要極少量的樣品（20-40微升）用於分析LD光譜。系統的另一個優點是對樣品的循環使用，允許對每個樣品的重複測定，減少了最終錄得譜的背景噪聲影響。

它的操作模式非常簡單，將樣品放在一個旋轉的管和一個固定棒之間。樣品在管中不斷旋轉，光束照射通過樣品，從水平偏振光計算得平行吸收，從垂直偏振光計算得垂直吸收。庫埃特流UV LD是現在唯一商業上適用的平均LD取向方法

拉伸薄膜

拉伸薄膜線二色性譜是基於合併樣品分子和聚乙烯薄膜^[3]的取向方法。拉伸聚乙烯薄膜導致原本隨機取向的分子'跟隨'薄膜的運動。薄膜的拉伸導致樣品分子和拉伸方向取向一致。

參考書目[編輯]

^ Alison Rodger and Bengt Nordén, Circular Dichroism and Linear Dichroism (1997) Oxford University Press, Oxford, UK. ISBN 019855897X.
^ Hannon, M.J., Moreno, V., Prieto, M.J., Molderheim, E., Sletten, E., Meistermann, I., Isaac, C.J., Sanders, K.J., Rodger, A. 「Intramolecular DNA coiling mediated by a metallo supramolecular cylinder」 Angewandte Chemie, 2001, 40, 879−884
^ Heinz Falk, Gunther Vormayr, Leon Margulies, Stephanie Metz and Yehuda Mazur 『A Linear Dichroism Study of Pyrromethene-, Pyrromethenone- and Bilatriene-abc-Derivates』 1986, Monatshefte fur Chemie, 117 : 849-858.

[1] Alison Rodger and Bengt Nordén, Circular Dichroism and Linear Dichroism (1997) Oxford University Press, Oxford, UK. ISBN 019855897X.

[2] Hannon, M.J., Moreno, V., Prieto, M.J., Molderheim, E., Sletten, E., Meistermann, I., Isaac, C.J., Sanders, K.J., Rodger, A. 「Intramolecular DNA coiling mediated by a metallo supramolecular cylinder」 Angewandte Chemie, 2001, 40, 879−884

[3] Heinz Falk, Gunther Vormayr, Leon Margulies, Stephanie Metz and Yehuda Mazur 『A Linear Dichroism Study of Pyrromethene-, Pyrromethenone- and Bilatriene-abc-Derivates』 1986, Monatshefte fur Chemie, 117 : 849-858.

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