柱色谱法

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1950年代一名使用柱色谱法的化學家

柱色谱法英语:Column chromatography,又稱為柱层析,俗称过柱子[1][2])是一种制备性色谱(Preparative chromatography),在化学中是最为常用的从混合物中分离纯净物的分离方法,它可以分离从毫克到公斤级别的产物。柱色谱的主要优点是相对的低成本和可处理的固定相,选用的固定相可以避免重复利用的交叉污染和固定相的分解。

操作[编辑]

用于柱色谱的自动组分收集器及取样器

常见的制备性色谱柱是直径5mm至50mm的管状玻璃仪器,高5mm至1m,底部有旋塞,柱体底部间通常塞有多孔玻璃块或玻璃纤维以支撑填料。色谱柱的装填主要有两种方法:

  • 干法装填。首先往柱体装入干燥的固定相粉末,然后自顶部加入流动相溶剂,冲洗直至整个固定相被溶剂浸没。
  • 湿法装填。首先将固定相和流动相溶剂混合制成悬浊液,关闭色谱柱旋塞,柱体竖直,均匀地将悬浊液倒入,注意不能产生气泡。倾倒最好一次完成,否则固定相间断层影响分离效果。等待片刻,固定相沉降,有时用塑胶球轻敲柱体帮助固定相堆积密实。装填完成后顶端自然留有一段溶剂。

固定相装填完毕后,通常在其顶端铺上一小层硅藻土玻璃纤维棉花等材料,用来保护固定相顶层的形状不被流体搅乱。将液面调节至固定相顶端以上,硅藻土顶端附近,小心滴加含有待分离物质的溶液。溶剂自柱色谱上口补充,同时打开下旋钮开始洗脱。分离过程中必须保持液面在固定相顶端以上,否则将会出现气泡和裂缝。[3]如果发生干柱,吸附在固定相中的产物可能很难冲洗下来,需拆下使用溶剂溶解,造成时间上的消耗和产物上的损失。由于分离时间通常较长,有时在柱顶加上一溶剂球,或装满溶剂的分液漏斗,以保持液面可以持续高于柱顶一段时间,而不必一直在旁值守。

使用一系列按次序编号的锥形瓶或试管等接收溶剂,由于各组分通过固定相速度的差异,流出时间有差别,于是不同组分被分离到不同编号的容器中。通过旋转蒸发等手段浓缩产物。并且,较长时间的柱色谱分离可能耗费大量溶剂,旋蒸过后的溶剂可拿来重复使用。

对于有色物质的分离,可通过流出序列颜色判断产物位置,[4]然而,多数情况需要借助分析性色谱的方法判断。常用的方法例如取一组流出液点板,进行薄层色谱分析,硅胶板置于紫外灯下,从产物荧光判断组分。

柱色谱法的分离步骤

可同时操作数根色谱柱以提高分离效率,多通道收集器可实现区分不同组分的流出液,其原理是通过紫外-可见分光光度法荧光光谱监控流出液的组分。已有快速制备色谱仪实现自动化的分离和组分检测。[2]

固定相[编辑]

固定相通常为吸附性的粉末状固体。最常用的固定相是硅胶,其次是氧化铝。过去也有使用纤维素的。除此之外,离子交换色谱法英语ion exchange chromatography反相色谱法亲和色谱法扩张床吸附英语expanded bed adsorption也可用于柱色谱。固定相与待分离物质干重之比是一个评估固定相效率的重要参数,对于硅胶,这一比值在20:1到100:1之间,取决于待分离物保留因子的接近程度。[5]

流动相[编辑]

流动相或称洗脱剂,可以是单组份的纯溶剂,但更多情况下选用一定比例的混合溶剂。流动相的选择对柱色谱分离至关重要。溶剂配比或根据文献,自己尝试时则需综合考虑产物和溶剂极性等因素。极性产物能被极性溶剂洗脱,而非极性产物能被非极性溶剂洗脱。[3]常使用薄层色谱法(TLC)测试各组分的保留因子,以确定固定相溶剂种类和配比。通常,保留因子在0.2至0.3之间较为合适,平衡了分离效率和溶剂消耗量。

流动相的流出速率影响分离的效果。较快的速率能缩短实验时间,并且减少扩散,因而使得分离效果更好。然而流速也不是越快越好,因为固定相和流动相之间平衡需要时间。范第姆特方程对影响分离效果几种主要因素进行了总结,根据此方程,流速当有一最优值。简单的柱色谱利用重力驱动洗脱,调节旋钮减慢流速,或者在柱顶加上溶剂球增加压力加快流速。需要更快的流速时,可使柱顶与泵或压缩气体(例如空气、氮、氩)相通,在液面以上加压,这种方法称为快速柱色谱(flash column chromatography)。[6][7]

快速柱层析中的固定相粒径一般比普通的小。前者最常用的粒径为230 – 400 (40 – 63 µm),而后者通常为70 – 230目(63 – 200 µm)。[8]

自动化系统[编辑]

一台自动化离子色谱仪

柱色谱是化学实验室中极为耗时的步骤,以至于成为实验室工作的效率瓶颈。基于此现状,很多实验室仪器制造商,包括Biotage、Buchi、Interchim和Teledyne Isco等公司已经开发了自动化的快速柱色谱系统,称为LPLC(low pressure liquid chromatography,低压液相色谱仪,工作压力350~525 kPa或50.8~76.1 psi),以期人力投入的最小化。LPLC通常含有更昂贵的高效液相色谱(HPLC)的组件,包括梯度泵,样品注入端口,UV检测器和馏分收集器。LPLC可分离毫克至千克级的产物,对于原本需要HPLC多次进样的情况提供更廉价的解决方案。

参考资料[编辑]

  1. ^ 过柱子是什么意思?柱子干了为什么可怕?. 网易新闻中心. 2015-07-20 [2017-01-29]. 
  2. ^ 2.0 2.1 上海科技大学自动过柱机(自动纯化系统)中标公告. 中国政府采购网. 2016-09-28 [2017-01-29]. 
  3. ^ 3.0 3.1 关烨第. 有机化学实验 第二版. 北京大学出版社. 2002年10月. ISBN 7301058594. 
  4. ^ 江洪. 基础有机化学实验. 科学出版社. 2015年7月: 74. ISBN 9787030449870. 
  5. ^ Setting up a flash chromatography column
  6. ^ Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041)
  7. ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice Illustrated. 13 Jun 1989: 180–185. ISBN 978-0-632-02017-1. 
  8. ^ Normal phase column chromatography, Material Harvest