埃德曼降解法
Edman降解（埃德曼降解，英语：Edman degradation），也根据所使用试剂而被称为“PTC法”或“PTH法”，是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔·埃德曼（Pehr Edman）首先创立。[1]
机理
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用异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, 缩写：PITC）与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯硫脲（PTC）的衍生物，于酸性条件之下生成五元环，肽链N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。
在1967年就出现了实现根据此原理设计的自动化仪器。[2]利用自动分析仪进行分析时，能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，一般只用10-100皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。对于肽链较长的多肽，可以先将肽链切断成多个小肽，对这些小肽进行氨基酸分析，然后将这些信息拼接起来，得到起始肽链中的氨基酸序列。
限制
[编辑]由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H，然后才能用Edman降解测测序列。
另外，由于所有反应都在封闭或体外的环境之下，势必会达到平衡，因此若在第一个试管里加入PITC，它会和试管内的第一个氨基酸的N-端氨基结合，可是由于平衡原理：PITC + 一段氨基酸序列 = PITC-氨基酸 + 少了第一个氨基酸的氨基酸序列，因此在第一个试管里会同时存在没有结合PITC和有结合PITC的氨基酸序列，这会导致我们将第一管有PITC-氨基酸的物质分离后，继续在第二个试管里加入PITC，则此时第二个试管里会含有少量的PITC-氨基酸(1)和多量的PITC-氨基酸(2)。这时候我们可以利用联用质谱法(Tandem mass spectrometry （页面存档备份，存于互联网档案馆）)等技术来分析，若分析后发现量多者为PITC-氨基酸(2)，量少者则为PITC-氨基酸(1)，因此我们就解决了反应不完全的问题。而另外一个问题也随之衍生，一旦我们不停地重复此步骤，得到氨基酸的序列时，一直到约第50个试管开始，就会发现所以氨基酸的量经分析后都会变得几乎一样，这样我们就没有办法可以知道氨基酸的序列。这也就是为什么我们需要先将一段大于50个氨基酸的序列用水解酶给进行切割，让所有片段的氨基酸序列小于50，这样我们才可以得到比较准确的氨基酸序列。
参见
[编辑]参考资料
[编辑]- ^ Edman, Pehr; Högfeldt, Erik; Sillén, Lars Gunnar; Kinell, Per-Olof. Method for Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides.. Acta Chemica Scandinavica. 1950, 4: 283–293. ISSN 0904-213X. doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283.
- ^ Edman, P.; Begg, G. A Protein Sequenator. European Journal of Biochemistry. 1967, 1 (1): 80–91. ISSN 0014-2956. doi:10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x.