植物组织培养
植物组织培养（英语：Plant tissue culture）是比较简化的名称，实际上包括了整株植物、器官、组织、细胞及原生质粒等不同层次的培养，将这些材料置于能供给生存条件的培养基上，并能在无菌的状况下使其正常生长的技术。[1]:1植物组织培养应用的范围相当广泛，在基础研究部分，可利用培养系统对植物细胞的营养、代谢、生长、分化、细胞遗传等领域进行探究；而在实际应用方面，则包含健康无菌苗的大量繁殖、人造种子的生产、种源保存、突变诱导、多倍体、细胞融合及二次代谢物的生产等，近年来更发展到基因克隆技术，对植物的改良与生产的增进都提供了更有效率的方式，为20世纪植物科学的一大突破。[1]:i
历史
[编辑]概念
[编辑]1838年及1839年，德国植物学家马蒂亚斯·雅各布·许莱登（Matthias Jakob Schleiden）以及泰奥多尔·许旺（Theodor Schwann），皆是从精子与卵子可以发育为完整生物体的观点出发，以细胞生物学理论进行推测，各自发表了有关细胞全能性的猜想，但因两人都没办法提出有力的实质证据，这样的讨论就因此停歇，然此概念却成为组织培养发展的重要启示。[2]:393
重要基础研究
[编辑]组织培养是许多科学技术之集大成而来的，因此若没有基础研究的堆叠，也不会发展出后来的组织培养技术。组织培养的起源最早可以追溯到1756年，法国植物学家亨利·路易·杜默·德·孟梭（Henri-Louis Duhamel du Monceau）对植物组织受伤后复原的探讨，并描述了有关愈伤组织形成的过程，被视为组织培养研究的先驱。[3]:807-818而后于1861年，德国专研无机盐养分的农业化学家威廉·克诺普（Wilhelm Knop）发表了克诺普培养液（Knop's solution），为培养基之无机盐成分组成奠下了根基。[4]:17最后则是于1884年，意大利植物学家朱利叶斯·维斯纳（Julius Wiesner）对植物细胞分裂调控做出详细探究，成为日后组织培养技术发展的重要基础。[2]:393
探索阶段
[编辑]1893年，奥地利植物学家卡尔·Ｈ·雷金格（Karl Heinz Rechinger），将植物的芽、根部等组织放置在湿润的砂砾上进行培养，欲探究植物组织增殖的限制。虽然此研究并非于无菌状态下操作，不符合现今组织培养的定义，却将“植物组织培养”的概念给实际化，因此被视为植物组织培养的先驱。[2]:39420世纪初，在细胞学说的推动下，奥地利植物学家戈特利布·哈伯兰特（Gottlieb Haberlandt）于1902年发表了《植物离体细胞培养实验 》[5]
提出了细胞全能性的猜想，推测离体细胞具有再生完整植株的潜力。为论证这一设想，他在加入蔗糖的克诺普培养液中以无菌方式培养单个离体细胞，期盼该细胞能进行分裂，再生为完整植株。遗憾的是，虽然能明显观察到该细胞的生长、细胞壁的增厚以及淀粉的形成等，但没有一个细胞被诱导并发生分裂，无法在当时以实验应证其假说。虽然如此，但哈伯兰特仍是第一个做到无菌细胞培养的科学家，也因此被尊称为组织培养之父。[6]:2-3
自哈伯兰特的实验之后，直到1934年菲利普·Ｒ·怀特（Philip Rodney White）培养番茄根尖细胞成功为止，中间32年，植物组织培养技术仍处于探索之中，整体进展不大，主要仅在两方面取得具深远意义的结果。一方面是胚培养的实验，1904年法国植物学家埃米尔·汉尼格（Hannig, Emil）在无机盐及蔗糖溶液中培养了胡萝卜与辣根菜的胚，并使这些胚在离体的下发育成熟。后来德国植物学家弗里德里希·莱巴赫（Friedrich Laibach）在1925及1929发表了有关亚麻种子杂交后代胚拯救之过程，证明胚培养在植物远源杂交育种应用之可能性；另一部分是根培养的实验，1922年美国植物学家威廉·Ｊ·罗宾斯（William Jacob Robbins）与德国植物学家瓦尔特·寇特（Walter Kotte ）发表了有关根尖培养之结果，他们假设使用分化能力较强的细胞，会较容易进行组织培养，并以根尖细胞为试验材料，最终证实使用分生组织做培养会比较容易的假设。[6]:3另外，罗宾斯与同为美国植物学家的威利斯·Ｅ·曼尼华（Willis Edgar Maneval）于1923年共同发表了〈 植物根尖培养的更多可能性〉中首次创造了继代培养的概念，以每两周更换一次培养基的频率，将玉米的根细胞继代了20个星期。[7]
奠基阶段
[编辑]到了1930年代中期，植物组织培养领域有两大重要的发现：分别为维生素B与生长素对植物生长与发育的重要性。1934年，怀特由番茄的根尖建立了第一个活跃生长的无菌系植物组织培养（7天继代一次，共继代160次[8]），被视为是组织培养“真正的成功”为其后的研究奠定重要的基础。起初，他在实验中使用的培养基由无机盐、酵母萃取物和蔗糖组成。于1937年，他在番茄根尖细胞培养的实验中，将原配方中的酵母萃取物替换为吡哆醇、硫胺和烟酸，证实了维生素B对于细胞组织培养的重要性[9]，并加以改良，成为现今仍被广泛使用的White培养基。同样于1934年，法国植物学家罗杰·Ｊ·高瑟雷（Roger Jean Gautheret）在岩槭、西洋接骨木、黄花柳形成层的组织培养中发现，虽然组织能在含有葡萄糖及半胱氨酸的培养液中不断增殖数个月，但只有在培养基中加入维生素B和生长素后，形成层组织的生长才会显著增加。[10]以此实验作为基础，于1939年，高瑟雷成功诱导并连续培养胡萝卜愈伤组织，与同样于1939年发表了烟草以及胡萝卜的连续生长培养物的怀特及法国植物学家皮埃尔·诺贝古（Pierre Nobécourt）共同被誉为植物组织培养的奠基人。[2]:396现在所用之培养方法与培养基，多是由这三位学者于1939年所建立方法和培养基演变的结果。[6]:3
另外，于1940年代，组织培养技术的另一项发展是由美国植物学家范欧贝克（VanOverbeek）以及阿尔伯特·Ｆ·布莱克斯利（Albert Francis Blakeslee）所共同发表，他们发现若在培养基内加入椰子水，会增加愈伤组织增值速度，表现甚至较使用生长素还要好[11]，且在英国植物学家弗雷德里克·Ｃ·史都华（Frederick Campion Steward）的推广下，椰子水配方被广泛的使用于组织培养领域，然而，其背后的机制待到1950年代， 才被正式厘清。1951年美国植物生理学家福尔克·Ｋ·斯科格（Folke Karl Skoog）与中国植物生理学家崔澂共同发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除生长素对于芽造成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素比例是控制芽和根形成的主要条件之一。于 1955 年，斯科格正式将6-糠氨基嘌呤从酵母萃取物中分离出来，并命名为激动素（kinetin），并在之后被归类为细胞分裂素。[6]:3
快速发展阶段
[编辑]1960年之后，植物组织培养进入了快速发展时期，在研究内容上更加深入与扎实，且开始走向大规模生产的应用阶段。[6]:5
英国植物学家爱德华·C·科金（Edward Charles Cocking）于1960年时，用真菌纤维素酶分离，并培养大量的番茄根细胞原生质粒，开创了植物原生质粒培养与体细胞融合杂交的研究工作。同年，法国植物学家乔治·莫雷尔（George Morel）发展出了兰科植物的茎顶培养，使兰科植物的大量繁殖成为可能，这一技术使欧洲、美洲和东南亚的兰花工业随之兴起。[6]:51962年，威斯康星大学的村重敏夫（Toshio Murashige）和福尔克‧K‧斯科格（Folke Karl Skoog）发表了促进烟草组织快速生长的培养基，其部分无机盐的浓度相较于先前较常用的克诺普培养液来的高出很多，特别是NO3以及 NH4的含量，更超出了克诺普培养液的25倍以上，而这样的配方，也在之后被广泛改良与使用，并冠上两人的名字，简称为MS 培养基[12]:171。1964年，印度植物学家西普拉古哈（Sipra Guha）与萨提许·钱德拉·马赫什瓦里（Satish Chandra Maheshwari）成功地透过曼陀罗花药培养获得单倍体植株，这一发现掀起了使用单倍体技术来加速育种的热潮，直至现在，对花药进行诱导仍是产生单倍体植株时十分常见的方法。[13]1971年，日本植物学家永田敏行与武部格首次获得了烟草的原生质粒再生植株，这一成功不仅促进了体细胞杂交技术的发展，也为外源基因导入提供了理想的材料。[6]:51972年彼得·Ｓ·卡尔森（Peter S. Carlson）成功的将两种烟草透过体细胞融合的方式进行杂交，其后原生质粒植株再生与体细胞杂交研究，就一直是组织培养领域所发展的重点，发展速度也逐渐由迅速变成广泛而缓慢。[6]:5
应用
[编辑]植物组织培养已广泛应用于植物育种，在单倍体育种、胚培养、体细胞杂交、细胞突变体筛选等方面均取得了显著的成就。[6]:6
育种
[编辑]花药培养与单倍体诱导
[编辑]自古哈与马赫什瓦里在1964年获得单倍体植株以来，目前全世界已约有300种以上的植物成功透过花药或花粉培养的方式取得单倍体植株，且在取得单倍体后，若以秋水仙素处理使其染色体加倍，则可迅速获得基因型纯合的后代，较传统上需透过多代自交才得以得到纯系之方法，具有更高的效率。[6]:6此外，单倍体植株容易表现基因的突变，且尤其是隐性的基因突变，因此也是做为诱变得理想材料。[1]:85
不同植物行花药培养的效率不同，必须注意植物种类、品种、植株生长状态、花粉发育阶段与时期、培养基成分及荷尔蒙的种类与浓度均因植物种类而异。花药培养后依植物种类不同而有两种发育途径，一为由花粉粒直接发育为胚，形成植株，另一途径则由花粉粒先形成愈合组织，再由愈合组织再生植株。不论经由哪一个途径发育，形成的植株中除了单倍体脂外，也会有染色体自然加倍的同型结合二倍体，甚至三倍体以上的多倍体出现，因此必须进行染色体的检定以进行确认。[1]:85
胚培养
[编辑]早在1940年代，胚培养就已被用来克服植物远源杂交之不亲合性。将幼胚发育至特定日数时进行离体培养，使自然条件下早夭的幼胚有机会因此发育成熟，获得杂种后代，目前已在50多科属中获得成功。[6]:6
体细胞杂交
[编辑]体细胞杂交可以打破物种间的生殖隔离，实现原先困难的基因交流，是改良植物品种并创造新类型植物的有效途径。目前体细胞杂交，主要是透过原生质粒融合进行，电融合以及PEG法为目前最主流的体细胞融合法。[1]:104透过体细胞杂交，目前已选育出细胞质雄性不稔烟草和水稻、马铃薯、番茄、甘薯、马铃薯与番茄的交种、甘蓝与白菜的交种等创新品系。[6]:6
细胞突变体筛选
[编辑]在组织培养的过程中，培植体细胞处于不断分裂的状态，易受培养基成分与外界压力的影响而产生变异。大量研究表明，细胞层级的分裂，其突变频率远高于个体或器官层级的诱变，且能在较小空间内一次处理大量材料。若是透过体细胞胚胎发育途径再生植株，还可克服个体或器官层级诱变时较易出现的嵌合体现象，获得同质突变体。目前，运用体细胞无性系变异以及离体诱变技术已获得一批抗病虫、抗杀草剂、耐寒、耐盐的优质突变体。[6]:6
去病毒化与离体大量繁殖
[编辑]植物去病毒化与离体大量繁殖是目前组织培养应用最多、最有效的一个方面。许多植物，且特别是无性繁殖植物均受到多种病毒的侵染，造成严重的品种退化、产量降低与品质劣化问题。早在1943年怀特就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至没有病毒，也因此若将茎顶生长点切下单独培养，将可脱去病毒，获得无病毒植株。[1]:75利用这种方法，目前已在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种主要作物上大规模生产无病毒种苗。[6]:7
植物离体培养的优势在于快速、材料来源单一、遗传背景相同且不受季节和地区等条件限制，重复性好。离体快速繁殖效率较常规方法快数万至数百万倍。目前，世界上已建立了许多组织培养工厂，成为一个兴新产业。[6]:7
二次代谢物生产
[编辑]借由大规模的植物细胞组织培养，可以高效生产各种天然代谢物，如蛋白质、脂肪、糖类、酚类、生物碱、天然色素等物质。因此，近年来这一领域引起了人们的广泛兴趣与高度重视。常见的应用如，用细胞培养技术生产蛋白质，将给饲料和食品工业提供充裕的的原料；或是以组织培养大量生产人工难以合成的二次代谢物，以进行大规模的工厂化生产。[6]:7
种原保存
[编辑]利用植物组织培养进行离体低温或冷冻保存，可大幅减少所需人力、物力以及土地需求，并让需保护物种之基因组得以保留。同时，离体保存的材料不受病虫害威胁及季节上的限制，有利于国际间之种原交换与合力保存。[6]:7
基本设备与器材
[编辑]植物组织培养实验室不同于一般的生物或化学实验室，特别需要注意清洁、维持无菌以及培养环境条件的控制。因此除了基础设备以外，还需要特殊的空间以及设备。规划时，除了要遵守一般实验室规则，注重实验室安全与方便性，操作者使用时，更要充分熟习各项设备之特性，以利正确操作。[1]:2
实验室空间安排
[编辑]建立组织培养室，必须要有妥当的空间安排，将各个空间适当隔离，以避免互相干扰，且又能合理连系，以便各项仪器及设备能有效率的使用以及管理，得到理想的培养效果。[1]:2
| 空间 | 用途与注意事项 |
|---|---|
| 准备室 | 配制培养基、灭菌、各种培养用具存放及清洗、污染物暂存 |
| 接种室 | 植物材料接种无菌操作 |
| 培养室 | 培养材料置于控制环境下生长 |
| 观察室 | 观察、纪录、分析培养结果 |
实验室基础设备
[编辑]- 电动天平：秤药用，至少需可测0.001g
- 酸碱度仪：调整培养基酸碱值
- 电磁搅拌加热板：配制培养基，溶解琼脂及药品
- 微波炉：配制培养基，溶解琼脂及药品
- 冰箱：储存药品及培养基
- 蒸馏水制造设备：制造蒸馏水，精密的试验则需二次蒸馏水
- 纯水制造设备：制造去离子纯水
- Milli-Q 水制造设备：制造逆渗透处理的水
- 一般离心机 :收集细胞、试药、组织萃取等
- 微量试管离心机：收集微量材料、试药等
- 真空抽气机：减压抽气
无菌操作设备
[编辑]- 高压蒸汽灭菌釜：用于培养基、玻璃容器、金属器材及耐高温塑胶制品之灭菌
- 干热烘箱：用于玻璃容器及金属器材类之干燥与灭菌
- 无菌操作台：利用HEPA过滤网，阻隔空气中的微粒与菌类孢子，营造无菌的操作环境；一般可分为水平送风式与垂直送风式
- 紫外线灯：利用紫外线灯直接照射使操作台面、空间达到无菌
- 微孔过滤设备：用于处理不耐高温的药剂或培养基成分，以微孔过滤方式灭菌
- 超声波震荡器：用具清洁、植物材料表面之灭菌，尤其时表面有绒毛或凹凸不平之无菌材料
- 酒精灯：置于无菌操作台内，用于玻璃容器及金属器材之灭菌
发展方向
[编辑]光合自养组织培养技术
[编辑]光合自养组织培养技术，又称为植物无糖组织培养技术，主要概念是以去除植物培养基中的糖分，使植物仅倚赖光合作用自养生长。此项技术不仅能降低因为糖分所造成的染污风险，也能使植株更加健壮，进而增加驯化的成功率，更能减少植物组织培养过程中所需耗费的成本与人力资源，是未来组织培养发展的重点方向。[14]:184-185[15]:3-13
低成本之组织培养技术
[编辑]组织培养技术，虽然较传统之生产方法来说更具有效率与稳定性，然而高额的成本，一直是组织培养在商业生产上的硬伤。而目前对于减少组织培养成本之研究有三个主要的方向，分别为增加目标产物增殖之效率，发展更节省人力之组织培养程序以及发展非生长室之植株培养方式，盼能降低组织培养所需之成本。[15]:10-13
相关条目
[编辑]参考文献
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