桑格測序

雙脫氧鏈終止法（英語：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又稱桑格法（英語：Sanger method），為一種常用的核酸測序技術，用於DNA分析，由英國生物化學家弗雷德里克·桑格於1977年發明。雙脫氧鏈終止法與化學降解法以及其衍生方法統稱為第一代DNA測序技術，為人類基因組計劃所使用主要測序方法。

原理

雙脫氧鏈終止法採用DNA複製原理。 Sanger測序反應體系中包括目標DNA片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測序引物及DNA聚合酶等。測序反應的核心就是其使用的ddNTP：由於缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或熒光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。

測序反應過程

早期基於Sanger法的測序設置了四個平行的測序反應，每一個反應中分別包括目標片段、DNA聚合酶、測序引物、四種dNTP和一種特定類型熒光（或放射性同位素）標記的ddNTP（即不同的反應中分別為ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）。通過這樣的配置，在不同的反應中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位中止，並形成不同長度的DNA片段。這些片段隨後可被凝膠電泳分開並顯示出來。變性丙烯酰胺電泳有四個泳道，每個泳道對應一種鹼基。電泳結束後通過放射自顯影或紫外顯影可讀出X光片或凝膠影像。圖像中的每一個暗帶表示一個雙脫氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）摻入後鏈終止的DNA片段的結果。四個泳道之間的不同暗帶的相對位置可以用來讀取（從底部到頂部）DNA序列，從而得到該目標片斷的鹼基排列順序。如圖A所示，該DNA片段的序列順序為ATGCTTCGGAT。

隨著Sanger測序技術的發展，ddNTP的標記技術有了很大的提高。不同種類的ddNTP可以被不同熒光基團所標記，而這些熒光基團具有相同的激發波長和不同的發射波長，因而在光學上表現為不同的顏色。因此，測序反應可以在一個體系中進行，滿足了業界對測序速度、自動化及通量不斷提高的要求。如圖B所示，原本四個不同的測序反應被單一測序反應所取代。

自動化測序儀

桑格法操作簡便，因此被廣泛使用，在其基礎上衍生出熒光自動測序技術等。基於熒光標記和雙脫氧鏈終止法的熒光自動測序儀被廣泛使用，用於人類基因組計劃等項目。基於毛細管電泳技術，Sanger測序現在已經可以在高度自動化的測序儀中進行，商用的產品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx與3500Dx xL測序儀及Beckman的GeXP遺傳分析系統等。這類系統最長可測定600-1000bp的DNA片段，且對重復序列和多聚序列的處理較好，序列準確性高。但是，這類測序儀在24h內可測定的DNA分子數一般不超過10,000個，通量較低，每鹼基測序成本較高，不適合大規模平行測序。其中ABI的3500Dx系列最近獲得美國FDA、歐盟與中國SFDA批准，成為第一台進入臨床使用的基因測序儀。

參考文獻

解增言; 林俊華; 譚軍; 舒坤賢. DNA测序技术的发展历史与最新进展. 生物技術通報. 2010, (8): 64–70. doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.08.014. CNKI SWJT201008013.
宋一鳴; 石成華. 以双脱氧链终止法测定dG、dC接尾的cDNA克隆序列. 遺傳. 1988, (1): 28–29. doi:10.16288/j.yczz.1988.01.011. CNKI YCZZ198801011.
Niedringhaus TP et al. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies, Anal. Chem., 2011, 83 (12), pp 4327–4341, DOI: 10.1021/ac2010857

參見