桑格定序
雙去氧鏈終止法（英語：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又稱桑格法（英語：Sanger method），為一種常用的核酸定序技術，用於DNA分析，由英國生物化學家弗雷德里克·桑格於1977年發明。雙去氧鏈終止法與化學降解法以及其衍生方法統稱為第一代DNA定序技術，為人類基因組計劃所使用主要定序方法。
原理[編輯]
雙去氧鏈終止法採用DNA複製原理。 Sanger定序反應體系中包括目標DNA片段、去氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙去氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、定序引子及DNA聚合酶等。 定序反應的核心就是其使用的ddNTP：由於缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或螢光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。
定序反應過程[編輯]
早期基於Sanger法的定序設置了四個平行的定序反應，每一個反應中分別包括目標片段、DNA聚合酶、定序引子、四種dNTP和一種特定類型螢光（或放射性同位素）標記的ddNTP（即不同的反應中分別為ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）。 通過這樣的配置，在不同的反應中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位中止，並形成不同長度的DNA片段。這些片段隨後可被凝膠電泳分開並顯示出來。變性丙烯醯胺電泳有四個泳道，每個泳道對應一種鹼基。電泳結束後通過放射自顯影或紫外顯影可讀出X光片或凝膠影像。圖像中的每一個暗帶表示一個雙去氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）摻入後鏈終止的DNA片段的結果。四個泳道之間的不同暗帶的相對位置可以用來讀取（從底部到頂部）DNA序列，從而得到該目標片斷的鹼基排列順序。如圖A所示，該DNA片斷的序列順序為ATGCTTCGGAT。
隨著Sanger定序技術的發展，ddNTP的標記技術有了很大的提高。不同種類的ddNTP可以被不同螢光基團所標記，而這些螢光基團具有相同的激發波長和不同的發射波長，因而在光學上表現為不同的顏色。因此，定序反應可以在一個體系中進行，滿足了業界對定序速度、自動化及通量不斷提高的要求。如圖B所示，原本四個不同的定序反應被單一定序反應所取代。
自動化定序儀[編輯]
桑格法操作簡便，因此被廣泛使用，在其基礎上衍生出螢光自動定序技術等。基於螢光標記和雙去氧鏈終止法的螢光自動定序儀被廣泛使用，用於人類基因組計劃等項目。 基於毛細管電泳技術，Sanger定序現在已經可以在高度自動化的定序儀中進行，商用的產品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx與3500Dx xL定序儀及Beckman的GeXP遺傳分析系統等。這類系統最長可測定600-1000bp的DNA片段，且對重復序列和多聚序列的處理較好，序列準確性高。但是，這類定序儀在24h內可測定的DNA分子數一般不超過10,000個，通量較低，每鹼基定序成本較高，不適合大規模平行定序。其中ABI的3500Dx系列最近獲得美國FDA、歐盟與中國SFDA批准，成為第一台進入臨床使用的基因定序儀。
參考文獻[編輯]
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- Life Technologies 3500基因分析儀獲國家藥監局批准並宣布其與達安基因組建的合資公司推出 10 種檢測試劑盒 https://web.archive.org/web/20131110070420/http://prnasia.com/story/76962-1.shtml