位相差顯微技術

生物用位相差顯微鏡

位相差顯微技術是一種光學顯微技術，光線在穿過透明的樣品時會產生微小的相位差，而這個相位差可以被轉換為圖象中的振幅或對比度的變化，這樣就可以利用相位差來成像。

光線在穿過非真空介質時，會與介質發生作用從而產生振幅和相位的變化，這種變化與介質的性質相關。振幅的變化通常是由於介質對光的吸收，變化程度與波長也就是光的顏色相關，而介質的厚度、折射率的變化會導致光線相位的改變。人的眼睛僅能測量到達視網膜的光線的能量強度，而很難觀察到相位的改變，普通的光學顯微鏡也無法檢測相位的改變。然而相位的變化通常也會攜帶相當多的信息，但是在對光線進行測量的時候這部分信息就全部丟棄了。為了使相位變化的信息可以被觀察到，就需要將穿過樣品的光線與參考光源相結合，相干的結果可以顯示出樣品的相位結構。

位相差顯微鏡觀察樣品時不需要進行染色，在觀察細胞的時候也就不會對細胞標本產生傷害，因此這種顯微鏡可以用來研究細胞周期。

歷史

位相差顯微技術是二十世紀三十年代弗里茨·澤爾尼克在研究衍射光柵的時候發明的。在研究中，他認識到與參考光干涉是很有必要的，而為了最大化對比度，需要向參考光中引入相移，這樣可以產生完全的相消干涉。隨後，他認識到相同的技術可以用於光學顯微技術。首先需要在玻璃上精確蝕刻圓環，當將玻璃插入顯微鏡的光路中的時候，就會產生所需要的相移。這個技術稱為位相差技術。

光學顯微鏡觀察的許多對象如原生動物、細菌、精子的尾等等細胞結構在染色以前都是透明的。染色是一個非常困難和耗時的過程，而且有時還會對標本產生傷害。然而，觀察對象的密度和成分不同經常會使光線在穿過它們的時候產生不同的相移，因此他們有時候也被稱為相位物體。使用位相差技術可以使這些結構顯示出來，同時允許對活體標本進行研究。

位相差技術是顯微技術中的一個重大進步，它的發明人澤爾尼克因此榮獲1953年的諾貝爾物理學獎。目前，在大多數高級光學顯微鏡中都使用了位相差技術或提供可選的位相差套件，而它也被廣泛應用於為透明標本如活體細胞和小的器官組織提供對比度圖像。

原理知識

1. 環形光闌
2. 物平面
3. 相位板
4. 主像平面

左圖，插入式位相差光闌，自左向右為明場、Ph1、Ph2、Ph3檔位。右圖，徠卡HiPlan 10x/0.25 Ph1位相差物鏡，可見相位板。

聚光鏡和相位板對中操作時通過對中望遠鏡看到的情形，左圖聚光鏡環形光闌（亮環）和相位板（暗環）未對齊，右圖二者已經對齊。

目前主要應用的位相差顯微鏡的原理示意圖如右圖所示[1] （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館），它的核心是一個位於聚光器的孔徑光闌位置的環形光闌1和位於物鏡鏡頭後方的相位板。首先光線從照明用的燈絲內的一點射出，由場透鏡精確的聚焦在聚光器處的環形光闌的開放處。由於這個位置處在聚光器的前焦平面，光線在通過聚光器後將變成平行光。假設這兩束光線在標本平面2（也就是顯微鏡的載玻片的位置）不發生反射和折射，它們將平行的射入物鏡。由於所有的平行光都會聚焦在後焦平面上，物鏡的後焦平面是聚光器的前焦平面的共軛平面。而實際上，部分光線通過標本以後將會發生反射和折射，而後將在平面3處聚焦，因此平面3也是物平面的共軛平面。為了完成調整相位的需求，需要在此處添加一塊相位板。相位板的另一個作用是將未被標本影響的光線減弱，用相位對中望遠鏡觀察物鏡後方的相位板，可見減光材料形成的暗環。大多數現代顯微鏡廠商使用真空沉積法製造相位板，把電解質或金屬材料沉積在獨立鏡片上，或者直接加工在物鏡的某片透鏡表面。

在顯微鏡上啟用位相差成像，需要把正確尺寸的環形光闌和位相差物鏡對應起來，因此，位相差光闌和位相差物鏡都標明了相應的序號，以Phx(x為阿拉伯數字)標識。例如，準備使用位相差標誌為Ph2的x40物鏡，必須把Ph2位相差光闌裝入聚光鏡。Phx標識刻在位相差物鏡筒上，而光闌則以轉盤或者滑塊（見左圖）的方式切換。

要使位相差顯微鏡清晰成像，必須將環形光闌和相位板的中心對準。在調整的過程中，使用相位對中望遠鏡暫時取代一個目鏡，通過望遠鏡觀察環形光闌和相位板，然後調節環形光闌的位置，直到二者對齊。

曾經有過一種有趣的位相差設計的變種，在這個設計中，匹配環被一個十字形的傳輸縫代替，而位於物鏡共軛平面的相位環被一個十字形的相位板代替。這個設計的優點是在所有的相位物體的放大過程中只需要一個縫狀光圈，而十字的形狀使得重新對齊中心和旋轉對齊非常容易，因此調整不再需要使用對中望遠鏡了。

一些型號的顯微鏡在出廠前已經預先校準聚光鏡系統，用戶不需要自己進行位相差對中操作。此外，位相差物鏡也可以用於明場觀察，只需將環形位相差光闌移出聚光鏡的光路，切換為明場照明即可。

技術細節

位相差顯微鏡的原理圖中省略了一些細節。首先，聚光環僅僅是一個位於平面1中央的小光圈，而相位板也僅僅覆蓋在了平面3中央的小光圈上。其次，物鏡、目鏡燈光學系統被極大的簡化了，圖中僅使用了兩個透鏡來代表所有的光學器件。

D波與S波

為了進一步的理解位相差照明的工作原理，我們來研究兩個波陣面（如左圖）。平面1處在聚光器的前焦平面上。光線通過小孔S射入，通過聚光器射出後形成平行的波陣面。當這些平面波碰到物平面2處的位向物體O的時候，一些光在穿過標本時被折射。假設標本不會顯著的改變入射光的振幅，而僅僅改變了它們和參考光之間的相位關係，新產生的球面波前在從標本射出後相位將被延遲90° （λ/4）。注意到現在有兩種類型的波，作為參考光的S波和折射光D波，它們之間存在這90° 的相差。物鏡將D波在主像平面，也就是圖中的平面4的內部聚焦，而S波將在其後焦平面，也就是平面3上聚焦。相位板P現在對S波有顯著影響，而大多數的D波卻不受影響。在正位相差中，相位板將所有穿過它的光線的振幅衰減約70-90%，而將相位提前90°，這樣，由於S波和D波的相位差達到180°，將引起相消干涉（180°的相移來自兩種效果的疊加，S波被相位板提前了90°，D波被相位物體延遲了90°）。如果沒有相位板，就不會有顯著的相消干涉，這樣就會導致對比度的降低。通過位相差照明的技術，不可見的相位變換現在可以轉變為可見的振幅變化。相消干涉在左圖中可以看到，藍色的波形和橙色的波形分別代表D波和S波，而他們的和，（D+S）的振幅減小了。

使用4F相關器實現位相差功能

使用4F相關器實現位相差功能。

從右圖可以看到位相差顯微的工作原理，其中使用了4F相關器，實現了位相差功能。在這張示意圖中，放大倍數為1，因此還不能從真正意義上稱之為顯微鏡。

按照圖中標記的符號，我們假定一個平面波從左方射入而相位傳遞函數的形式為 ${\frac {}{}}T(x,y)=e^{j\phi (x,y)}$ 其中指數上的$\phi (x,y)$被稱為傳遞函數的相位。如果相位物體很薄，使得$\phi (x,y)<<1$，那麼 $T(x,y)=e^{j\phi (x,y)}\cong 1+j\phi (x,y)$。

通常的膠片和檢測器都只能響應振幅變化，而不能響應相位變化。但是上面的傳遞函數的振幅變化非常小，因此對比度不夠高。為了最大化對比度，我們需要讓這兩項變成同相，而不是正交，因此$\phi (x,y)$ 的變化可以直接影響傳遞函數的振幅。我們可以通過有選擇的在其中一項上乘以一個係數 j，以使兩項同相。這個任務可以通過4F相關器來實現。我們假定一個平面波射在相關器的輸入平面上，也就是圖中的最左端。相位傳遞函數${\frac {}{}}T(x,y)=1+j\phi (x,y)$的傅立葉變換可以在第一個透鏡的後焦平面上產生，其形式為${\frac {}{}}T(k_{x},k_{y})=PSF(k_{x},k_{y})+j\Phi (k_{x},k_{y})$，其中$PSF(k_{x},k_{y})$被稱為透鏡的點擴散函數。點擴散函數僅僅是第一個透鏡後焦平面上的一個小點，而相位函數的分布更大。由於點擴散函數在一個很小的區域上，我們可以將一個很小的能夠產生四分之一相移的物體放在那裡，使$PSF(k_{x},k_{y})$產生四分之一相移，而其它部分的相位函數$\Phi (k_{x},k_{y})$ 基本上不會發生變化。

這樣，在焦點的後面，場變成了${\frac {}{}}E(k_{x},k_{y})=jPSF(k_{x},k_{y})+j\Phi (k_{x},k_{y})$，而現在兩項都是同相的了。然後我們再將這個場分布通過第二個透鏡進行傅立葉變換，於是，在最右側的輸出平面上可以得到輸出的場分布${\frac {}{}}E(x,y)=1+\phi (x,y)$。這時，我們可以忽略兩項共有的係數j'，而相位函數$\phi (x,y)$將直接調製振幅，使得圖像的對比度增強。

相對於DIC技術的優勢與不足

在倒置生物顯微鏡上進行活細胞觀察，使用ph2位相差光闌和x40位相差物鏡通過T25細胞培養瓶（25平方厘米生長面積，聚苯乙烯塑料材質）成像，瓶中紅色液體為添加了酚紅和動物血清的MEM培養基，生長中的細胞貼附在底面內壁。右圖為視野中的情形（HeLa細胞）

相對於其它對比增強技術，如DIC，位相差顯微技術不使用偏振光照明，因而可以觀察雙折射介質，如透過塑料培養瓶或培養皿進行活細胞觀察，這在細胞學研究上特別有用。如和落射螢光技術連用，位相差物鏡可以透過約70%的激發光，優於DIC（相位板仍導致部分激發光衰減），所以位相差往往作為輔助成像功能應用在螢光顯微鏡上。此外，位相差套件的採購價位相對較低，使用調校也較為簡單。

位相差顯微技術存在一些固有的不足。由於必須使用環形光闌，啟用位相差照明時聚光鏡的數值孔徑有所限制，所以位相差成像的軸向解析度較低。另外，標本和背景折射率差異較大的分界處會出現明顯的光暈，導致如細胞膜、細胞器外緣等位置的細節被遮蔽。

圖像特點

位相差顯微鏡現實的圖片的特徵是灰色的背景上面可以顯示出明暗的樣品結構。明暗的邊緣表示了樣品光學密度的變化，例如，細胞和水的邊界，這也通常表現為在暗的物體周圍會有明亮的光暈。

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  臉頰上皮細胞在位相差顯微鏡下的圖像。
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  未染色的洋蔥根尖細胞塗片，徠卡HiPlan 100x/1.25 oil Ph3位相差物鏡拍攝，左圖使用ph3位相差光闌照明，右圖使用明場照明。
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  透過T25細胞培養瓶拍攝的HeLa細胞
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  HeLa細胞三極有絲分裂（箭頭處）。

• 用於產生紙巾樣品對比度的透射技術比較。1.559微米/像素。
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  位相差照明，樣品的對比度來自穿過樣品中不同長度光路的光線的相干。
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  亮場照明，樣品的對比度來自對樣品不同部位對光線的吸收。
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  偏光顯微技術，樣品的對比度來自樣品不同部位對偏振光的不同旋轉程度。
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  暗場照明，樣品的對比度來自樣品散射的光線。

另見

• Murphy, Douglas B Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, John Wiley & Sons (2001)
• Pluta, Maksymilian, Advanced Light Microscopy, Vol 2, Specialized Methods, Elsevier and PWN-Polish Scientific Publishers (1989)
• Zernike, F., Phase-contrast, a new method for microscopic observation of transparent objects. Part I.., Physica: 9, 686-698 (1942).
• Zernike, F., Phase-contrast, a new method for microscopic observation of transparent objects. Part II.., Physica: 9, 974-986 (1942).
• Zernike, F., How I discovered phase contrast., Science: 121, 345-349 (1955).
• 其它參考文獻 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）

外部連結

• 諾貝爾獎：位相差顯微鏡 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
• 位相差照明 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
• Molecular Expressions （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）: 位相差顯微技術 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
• Microscopy University （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）: 位相差顯微技術原理 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）
• Microscopy University （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）: 位相差顯微技術原理 （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）