膜片鉗
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膜片鉗技術(英語:patch clamp technique)是一種電生理學實驗技術,用於研究組織切片、單個分離細胞或一小塊細胞膜的離子電流。這項技術可應用於研究可興奮細胞(excitable cells),比如神經元、心肌細胞、肌細胞和胰島β細胞,也可以應用於細菌特別是製備的大型原生質球上的離子通道研究。
膜片鉗技術可以有電壓鉗和電流鉗兩種設置,在電壓鉗中,設備通過負反饋電路維持細胞跨膜電位在某一數值來觀察跨膜電流的變化,而在電流鉗中,微電極向細胞內注入恆定或變化的電流,記錄相應膜電位的變化,如動作電位的形成。
德國馬普生物物理化學所的厄溫·內爾與伯特·薩克曼在二十世紀七十年代末到八十年代初開發了膜片鉗這項技術[1]。這一發明使得記錄單個離子通道的電流成為了可能,這幫助人們更好地理解了離子通道參與的基本細胞過程,如動作電位和神經活動。兩位教授也因這項工作獲得了1991年的諾貝爾生理學或醫學獎[2]。
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基本技術
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在膜片鉗的記錄過程中,一個空心的硼矽酸鹽尖頭玻璃管內含一根金屬絲和電解質溶液作為記錄電極,尖端接觸到細胞,後端連接信號放大器來記錄電信號。另有一個置於浴液(bath)中的參比電極記錄零信號,記錄電極和參比電極之間可以形成一個電路,將目標的細胞置於兩者之間。
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記錄電極中的電解質溶液儘可能要與浴液中的離子組成相匹配(在細胞貼附記錄的模式下),或與細胞質中的離子相匹配(在全細胞記錄的模式下)。浴液中的離子要儘可能匹配細胞或組織正常的生理條件,或者實驗要求的非生理條件。研究人員還可以在浴液或電極液中通過添加離子或藥物來研究不同條件下的離子通道。
根據實驗目的的不同,記錄電極尖端的大小也會有所不同,但通常在幾微米的範圍內[3]。這一小的尖端只覆蓋一小塊細胞膜表面區域,或稱為「膜片」(patch),通常只包括幾個或一個離子通道分子[4]。這種電極不同於刺穿細胞膜來檢測胞內電信號的「尖銳微電極」(sharp microelectrode),只是附著在表面而非深入細胞。
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在一些實驗中,玻璃管需要在拉針儀(pipette puller device)中加熱以產生光滑的尖頭表面,使其和細胞膜的密封性更好,從而有更高的電阻。同時為了獲得更好的密封,需要向記錄電極給與一定負壓,使得細胞膜的一部分被吸到尖頭中,形成Ω形狀的細胞膜區域,最終使得電阻到達10到100G歐姆的範圍內,稱為「高阻封接」(gigaohm seal或gigaseal)[4]。這種密封形成的高電阻使得很難有其它電流形成,極大地降低了電信號噪聲,並為記錄提供一些機械穩定性[5]。
記錄
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膜片鉗技術在電壓鉗設置下,通過差分放大器來記錄記錄電極和作為零信號的參比電極之差,使得研究者可以將膜電位固定在某一數值,來觀察細胞膜電流的變化。在這些記錄過程中,記錄電極是以參比電極為對照。向細胞內注射一定的電流,以此來固定細胞膜電位在某一數值。由於注無線電流的大小和離子流的大小相等、方向相反,因此它可以反映細胞膜離子流的大小和方向[4]。
而在全細胞記錄模式下的電流鉗,可向細胞內注射恆定的電流刺激,記錄由此引起的膜電位的變化[6]。
基本記錄模式
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膜片鉗技術有幾種基本的記錄模式,這取決於研究者想研究什麼。其中內面向外和外面向外記錄模式為游離膜片的記錄模式,因為這個膜片跟細胞主體是分離的。細胞貼附記錄模式和兩種游離膜片記錄模式都被用來記錄電極尖端下這片細胞膜上的單離子通道電流。
研究者可以通過全細胞記錄模式和穿孔膜記錄模式來獲得整個細胞的離子通道電流,而不單單是單個離子通道的電流。全細胞記錄時電極電阻較低(開口較大,電阻僅有2-10 MΩ,易於進行電壓/電流鉗制)很大程度上降低了由高電極電阻所帶來的噪聲,電極電壓也變得很小,可以更好的記錄到整個細胞膜上的離子通道電流。
細胞貼附式
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細胞貼附式記錄模式,用玻璃電極尖端吸附細胞膜表面,形成緊密高阻封接,同時確保細胞膜的完整性。然後對電極尖端下面積僅為幾平方微米的細胞膜片上一個或幾個離子通道的電流進行記錄。全細胞記錄由於電極只是附著在細胞表面,對細胞的結構幾乎沒什麼損傷[4]。此外,通過不破壞細胞內部,離子通道基本處於細胞的正常生理狀態下[7]。細胞貼附式記錄模式還是相對比較容易獲得真實可靠的實驗數據,並且所獲的信號是相當穩定的[8]。
細胞貼附式記錄模式常用於配體門控性離子通道或者由代謝型受體調控的離子通道,將神經遞質或者研究的藥物通常放入電極液中,與被電極鉗住的這一片膜充分接觸。由此引起的離子通道活性改變可以歸因於電極液中加入的某種受體激動劑,然而,此模式很難更換電極液中藥物的濃度。此記錄因此只能反映一小片細胞膜上的離子通道呈現劑量反映曲線中的一個點,故而,可以用幾個細胞或者一小片細胞膜上的離子通道來製作劑量反映曲線。另外,此模式可以測量「膜片」上的電壓門控離子通道的不同的膜電位。就某一通道而言,離子通道的激活是由電壓變化引起的,通過記錄流經一小片膜上的電流和通道兩側電壓差的比值,可以完整的繪製出電壓-電流關係曲線(I-V曲線)。細胞貼附式記錄模式另一個潛在的缺點就是,不像全細胞記錄模式那樣可進行細胞內灌注,如灌注藥物、信使物質、螢光染料等,貼附式記錄下的細胞不能被直接修飾。[8]
內面向外式
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內面向外記錄模式,是在細胞貼附式的基礎上,可經進一步處理使被電極吸附的一小片膜撕下,置於與細胞內液相似的浴液中[9]。此模式的一個優點就是,研究者可以通過浴液中添加相關藥物,來研究細胞膜的內表面,並可以修飾膜表面暴露的相關的化學成分。這對於當研究者想要控制單個離子通道的細胞內膜表面狀態時是具有可行性的。比如,可以通過更換一系列配體的濃度,來研究離子通道的細胞內成分的效應。
為了實現細胞膜內面向外的的單層膜片,就跟細胞貼附式一樣,用玻璃電極尖端吸附細胞膜表面,形成緊密高阻封接,然後將電極迅速提起,脫離細胞。因為細胞膜具有流動性,粘著在電極尖端上的細胞膜會自動融合,從而形成一個囊泡。可以通過將電極提出浴液液面短暫暴露在空氣中後,再次將電極放入浴液,或者將電極放入低Ca2+浴液中,或者通過跟一滴石蠟或一小塊固化的矽酮聚合物短暫的接觸,讓囊泡的外表面破裂,從而形成內面向外的記錄模式[10]。
全細胞記錄式
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全細胞式記錄,記錄的是除了被吸破的小膜片之外的整個細胞膜的電學參數,是多通道共同介導的電流。電極首先形成像細胞貼附式記錄一樣的構型,進一步對玻璃電極內施加負壓,使玻璃電極吸住的膜片破裂,電極內液和細胞內部相連通。我們可以利用這項技術來檢測某些處理對細胞的實時影響,例如藥物篩選[11]。電極尖端貼附在細胞膜上時,有兩種方法可以使細胞膜破裂。第一種是施加更大負壓,這取決於細胞類型和電極的孔徑。另一種方法是施加適當幅度、寬度的單脈衝電擊,對於有些細胞來說,這兩種方法聯合應用很容易使細胞膜破裂[8]。
和「尖銳微電極」的方法相比,全細胞式記錄的優點是微電極尖端的開口較大,得到更小的電阻,從而更好地測量細胞內部電信號[12][11]。缺點在於電極的容積大於細胞容積,細胞內容物會逐漸被電極內液取代,導致細胞內某些成分喪失,這也稱為電極內液對細胞內液的「透析作用」(dialyzing)[8]。記錄一段時間後,任何依賴於細胞內成分的性質都會改變。電極內液接近於細胞內的高鉀環境以最小化這種透析的影響,所以全細胞式記錄最好在透析之前完成記錄[8]。
外面向外式
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「外面向外」的名稱對應「內面向外」記錄模式,實際上它所記錄的細胞膜「外面」(而非細胞膜內面)朝向電極尖端「外」,故而稱之為外面向外[7]。
外面向外記錄模式是由全細胞記錄模式轉化而來的,形成細胞貼附記錄模式後,採用繼續施加負壓或電擊的方法打破細胞膜,形成了全細胞記錄模式後將電極緩緩提起,逐漸脫離細胞,電極揪住的一小部分細胞膜會脫離細胞,由於細胞膜的流動性,黏著在電極上的細胞膜會自動融合形成細胞膜外面朝向電極尖端外的囊泡(如同電極開口處的氣球)[7]。如右圖所示,這也意味著電極內的液體可以影響細胞內液。而操作者也可以自由移動吸管和囊泡到任意浴液中。如果囊泡較大且含有多個離子通道,該模式可以記錄多個離子通道,如果囊泡做夠小,小到只含有1個離子通道,該模式可以記錄1個離子通道[13]。
外面向外記錄模式可以讓我們記錄到離體的單離子通道,也便於更換細胞外液。即實驗者可以在短時間內將細胞膜外表面暴露在不同的浴液當中,一旦有細胞膜外面的神經遞質或是藥物影響到了離子通道,電極就會記錄到相應的電位變化[14]。相比較細胞粘附記錄模式,這種可以通過更換細胞外液而記錄一種細胞膜離子通道的電流變化更具優勢。另一方面該記錄模式也有缺陷,因為其步驟較多,膜片難以融合,本模式難以獲得高質量而穩定的記錄。
穿孔膜記錄式
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穿孔膜片鉗記錄模式與全細胞記錄類似,區別在於高阻封接後不對細胞進行破膜處理,它是利用記錄電極溶液中含有的少量的多烯類抗真菌劑或抗生素(如兩性黴素B、制黴菌素或短桿菌肽)在細胞膜上形成小孔,構成電流迴路[15]。對比全細胞模式與穿孔記錄模式,全細胞模式相當於一扇敞開的門,在這扇門裡,電極內液和細胞質中的分子發生完全交換。穿孔記錄模式可以比作一個紗門,它只允許電極內液中的某些分子交換到細胞質中。
與全細胞記錄相比,穿孔記錄模式的優點包括抗生素穿孔的特性,它只允許單價離子通過孔道,而二價離子和大分子不能通過孔道,這一特性有助於維持細胞內內源性二價離子如Ca2+和信號分子如cAMP的水平。因此穿孔模式可以像全細胞膜片鉗一樣記錄整個細胞,同時又可以像細胞帖附式一樣保留大多數細胞內的信號機制。結果就是穿孔記錄可減弱離子通道電流衰減,同時可進行一小時以上的長時間記錄[15]。缺點就是由於沒有完全穿透細胞膜,細胞膜串聯電阻高於全細胞模式,可能導致解析度降低及記錄噪聲變大。抗生素穿孔也需要相當長的時間(兩性黴素B大約需要15分鐘,而短桿菌肽和制黴菌素甚至需要更長時間)。電極尖端下的細胞膜由於抗生素形成的孔而減弱,並可能破裂。如果膜片破裂,記錄就會進入全細胞模式,同時抗生素也會污染細胞內部[15]。
鬆散封接式
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鬆散封接的膜片鉗不同於這裡討論的其他技術[1],它採用的是鬆散的密封(低電阻),而不是傳統技術中使用的緊密密封。早在1961年,該技術就已應用,Strickholm在論文中曾描述發現了肌細胞表面的阻抗[16],但沒有得到足夠關注。後來直到1982年Almers、Stanfield和Stuhmer等人再次提出,並重新定義之後[17],此項技術才得到足夠重視。
為了在細胞膜上形成鬆散膜片鉗,移液管緩慢地向細胞移動,使細胞和移液管之間的電阻增加數倍。移液管離細胞膜越近,移液管尖端的阻力就越大,但是如果太近就會形成密封,那麼就很難在不損害細胞的情況下移除移液管。對於鬆散膜片技術來說,移液管與細胞膜的距離不夠近,就不能形成密封或永久連接,也不能刺穿細胞膜[18]。細胞膜保持完整,由於沒有緊密的密封,所以形成了一個小孔,離子可以通過這個小孔從細胞外穿過而不進入移液管。
鬆散封接的一個顯著優點是,使用的移液管可以在記錄後反覆從膜上取下,而細胞膜保持完整。這就允許在同一細胞的不同位置重複測量,而不破壞膜的完整性。這種靈活性對於研究在真實生理條件下收縮的肌肉細胞特別有用,可以快速獲得記錄,而且不用採取極端措施阻止肌肉纖維收縮[17]。一個主要的缺點是移液管和薄膜之間的電阻大大減小,使得電流通過密封洩漏,大大降低了小電流的解析度。這種洩漏可以通過比較細胞上不同區域的記錄部分糾正。由此,鬆散封接適用的最低電流可以小於1 mA/cm2[18]。
全自動膜片鉗
[編輯]全自動膜片鉗技術是近年來膜片鉗技術的一個重大發展。它可以在較短的時間內以低廉的價格獲取大量數據。這樣的系統包括一個一次性的微流控裝置,一個用以捕捉細胞的注塑成型或聚二甲基矽氧烷(PDMS)鑄造晶片以及一個玻璃微電極。
在該系統中,微電極尖端施加的負壓促使細胞移進吸管口,電極尖端壁與細胞膜之間形成了高阻封接,然後將電極迅速提出溶液液面短暫地暴露在空氣中,粘著在電極尖端的自動融合形成的囊泡會破裂,再次將電極放入溶液就是內面向外記錄模式。在全自動膜片鉗系統中,記錄電極和已經內面向外的膜片可以快速移到下一個要檢測的化合物溶液中,記錄不同的藥物在相當於細胞膜內側位置的對離子通道的影響[19]。
另見
[編輯]參考文獻
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