流式细胞术
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流式细胞术（flow cytometry，FC，FCM）是用于对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、多参数定量分析和分选的技术。此技术使用流式细胞仪（flow cytometer）自动化地从混合的生物材料中分离和分析细胞、细胞器或生物大分子。
流式细胞术可对流过光学或电子检测器的生物粒子，检测标记的荧光信号，实现高速、逐一、连续的细胞分析。
原理
[编辑]一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直线上（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者膜的粗糙程度），至于荧光则用来标记和检测特定的细胞表面抗原或者DNA。
可以检测的参数有：
- 细胞的体积和形态复杂程度
- 细胞中的色素
- DNA（细胞周期分析[1][2]、细胞动力学、细胞增殖等）
- RNA
- 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）
- 蛋白质
- 细胞表面抗原（CD标记）
- 胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）
- 核抗原
- 酶活性
- pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势
- 膜流动性
- 细胞凋亡(apoptosis)
- 定量检测DNA降解
- 粒腺体膜电位通透性变化
- 细胞膜上不对称性的瓦解
- 细胞凋亡蛋白质活性侦测（caspase activity）
- 细胞存活能力
- 监测细胞电通透性
- 氧爆作用(oxidative burst)
- 研究癌细胞中的多重耐药性（multi-drug resistance, MDR）
- 谷胱甘肽
- 各种组合（DNA/表面抗原等等）
这个列表非常长，而且在不断地扩展。
流式细胞仪
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流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光激活细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。
一个流式细胞仪包括五个组成部分：
- 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式逐个通过光束。
- 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、激光二极管或激光二极管倍频（蓝、绿、红、紫）。
- 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。
- 放大系统，线性或对数放大。
- 计算机，用于分析信号。
早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同。
通过流式细胞仪获取样本数据的过程叫做“获取过程”（acquisition）。这个过程是以连接在流式细胞仪的计算机，和处理细胞计数器的软件为媒介的。其中，软件可以调节用于检测样本的不同参数值，如电压（voltage），补偿（compensation）等，并且在获取样本数据时协助样本信息的数字显示，以确保参数正确的设置。现代的流式细胞仪很多应用在荧光标记（ fluorescently labeled ）的抗体（antibody）上。
现代流式细胞仪通常拥有多种激光和多种荧光检测。 最近数据显示商用流式细胞仪有高达10种激光， 18种荧光检测器。这个数字的增长可以使得更多的抗体被标记，并且通过表现型标记（ phenotypic markers）识别到可观的样本数量。 有些设备甚是可以获取单个细胞的数字图像，用于分析荧光在细胞中的具体位置（比如细胞内部，细胞表面等）。
数据分析
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补偿（compensation）
[编辑]每种荧光染料都具有广泛的荧光光谱。 当使用多种荧光染料时，可能会发生荧光染料之间的重叠。 这种情况被称为频谱重叠。 这种情况需要克服。 例如，FITC和PE的发射光谱是荧光素发射的光在穿过用于PE的滤光片时重叠相同的波长。 通过从PE信号中去除一部分FITC信号来校正该频谱重叠，反之亦然。 这个过程被称为色彩补偿，它将荧光色素计算为百分比来衡量自身[3]。
圈选（gates）
[编辑]由流式细胞仪得到的数据可以由新的软件绘制成一维的柱状图（histograms）或是二维甚至是三维的位图（dot plots），进一步由所谓的"圈选"（gates）位图的方式，可将位图的点图区域不断地作一系列的分离及再分析。而特殊的圈选流程（protocols）对于血液学方面在临床上的诊断有相当的关连性。
这类位图经常以对数（logarithmic）尺标的方式来呈现。由于荧光染剂彼此会有光谱波长重叠的情形，而荧光波长呈现的讯号常会被来自荧光接受器的讯号所干扰，因此需由电子运算的方式进行荧光补偿（compenstation）。从流式细胞仪中获取到的数据可以通过以下软件进行分析：e.g., JMP_(statistical_software), WinMDI,[9] Flowing Software,[10] and web-based Cytobank[11] (all freeware), FCS Express （页面存档备份，存于互联网档案馆）, FlowJo, FACSDiva, CytoPaint (aka Paint-A-Gate),[12] VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt or Cytospec.[13] 一旦数据收集的过程已经结束，流式细胞仪就不用继续连接在计算机中。后续的数据分析可以在计算机中独立进行，这一点尤其用在一些高精度需求的仪器上。
计算分析
[编辑]最近在使用计算方法进行自动化群体识别方面的进展为传统的圈选策略（gating strategies）提供了一种替代方案。 自动识别系统可能有助于发现罕见和隐藏的种群。 代表性的自动化方法包括FLOCK[4]，免疫学数据库和分析门户（ImmPort）[5]，Bioconductor中的SamSPECTRAL [6]和flowClust[7][8][9]以及GenePattern中的FLAME[10]。
应用
[编辑]流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学、植物学、和海洋生物学等[11]。在分子生物学中，它主要用于荧光标记的抗体。特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的特别信息。这在医学中具有很广泛的应用，尤其是在器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学、精子分类（Sperm sorting）、和性别选择。此外，它广泛用于检测DNA损伤[12][13]，半胱氨酸蛋白酶切割和细胞凋亡的研究[14]。 在神经科学中，细胞表面的共表达（co-expression）和细胞外抗原（intracellular antigens）可以被分析[15]。
现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。
流式细胞仪也是很有用的分选仪器。当细胞/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。
海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻（Prochlorococcus）就是通过流式细胞术发现的。因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。
参见
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参考资料
[编辑]- ^ Ashraf M. Khalil. B Cell Signal Transduction in Germinal Center B Cells is Short-Circuited by Increased Phosphatase Activity. Science. 2012-06-01 [2019-05-11]. （原始内容存档于2021-05-26）.
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