游离DNA：修订间差异

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'''循环游离DNA（cfDNA）''' （也称为'''游离DNA'''，有时称为'''游离核酸'''）是释放到[[血浆|血浆、尿液]]、脑脊液等体液中的降解[[脱氧核糖核酸|DNA]]片段。 cfDNA 片段的典型大小反映了染色体颗粒 (~165bp) 以及多个核小体，可保护 DNA 免受凋亡核酸酶的消化。<ref>{{Cite journal |vauthors=Shtumpf M, Piroeva KV, Agrawal SP, Jacob DR, Teif VB |date=June 2022 |title=NucPosDB: a database of nucleosome positioning in vivo and nucleosomics of cell-free DNA |journal=Chromosoma |volume=131 |issue=1-2 |page=19–28 |doi=10.1007/s00412-021-00766-9 |pmc=8776978 |pmid=35061087}}</ref>游离核酸存在于细胞外，具有胞间通讯及免疫调节功能，贯穿机体生老病死各个过程，可用于描述在体液中自由循环的各种形式的DNA，包括循环肿瘤DNA（ctDNA） 、无细胞线粒体DNA （ccf mtDNA）、无细胞胎儿DNA（cffDNA）和供体来源的细胞DNA (dd-cfDNA)。 <ref name="MyUser_Onlinelibrary.wiley.com_March_6_2016">{{Cite journal |vauthors=Dholakia S, De Vlaminck I, Khush KK |date=November 2020 |title=Adding Insult on Injury: Immunogenic Role for Donor-derived Cell-free DNA? |journal=Transplantation |volume=104 |issue=11 |page=2266–71 |doi=10.1097/TP.0000000000003240 |pmc=7590963 |pmid=32217943}}</ref>在[[癌症]]中，尤其是在晚期疾病中，观察到 cfDNA 水平升高。 <ref name="MyUser_Ncbi.nlm.nih.gov_March_6_2016c">{{Cite journal |vauthors=Shaw JA, Stebbing J |date=January 2014 |title=Circulating free DNA in the management of breast cancer |journal=Annals of Translational Medicine |volume=2 |issue=1 |page=3 |doi=10.3978/j.issn.2305-5839.2013.06.06 |pmc=4200656 |pmid=25332979}}</ref>有證據表明，隨著年齡的增長，cfDNA 的循環變得越來越頻繁。 <ref name="MyUser_Onlinelibrary.wiley.com_March_6_2016c">{{Cite journal |vauthors=Gravina S, Sedivy JM, Vijg J |date=June 2016 |title=The dark side of circulating nucleic acids |journal=Aging Cell |volume=15 |issue=3 |page=398–9 |doi=10.1111/acel.12454 |pmc=4854914 |pmid=26910468}}</ref> cfDNA 已被证明是除[[癌症]]和胎儿医学之外的多种疾病的有用[[生物标记|生物标志物]]。这包括但不限于创伤、[[敗血症|败血症]]、无菌性[[炎症]]、[[心肌梗死|心肌梗塞]]、中风、[[器官移植|移植]]、糖尿病和[[鐮刀型紅血球疾病|镰状细胞病]]。 <ref name=":12">{{Cite journal |vauthors=Butt AN, Swaminathan R |date=August 2008 |title=Overview of circulating nucleic acids in plasma/serum |journal=Annals of the New York Academy of Sciences |volume=1137 |issue=1 |page=236–42 |bibcode=2008NYASA1137..236B |doi=10.1196/annals.1448.002 |pmid=18837954 |s2cid=34380267}}</ref> cfDNA 主要是一種雙鏈細胞外 DNA 分子，由小片段（50 至 200 [[碱基对|bp]] ） <ref>{{Cite journal |display-authors=etal |vauthors=Mouliere F, Robert B, Arnau Peyrotte E, Del Rio M, Ychou M |year=2011 |title=High Fragmentation Characterizes Tumour-Derived Circulating DNA |journal=PLOS ONE |volume=6 |issue=9 |page=e23418 |bibcode=2011PLoSO...623418M |doi=10.1371/journal.pone.0023418 |pmc=3167805 |pmid=21909401 |doi-access=free}}</ref> <ref name="pmid30404863">{{Cite journal |display-authors=6 |vauthors=Mouliere F, Chandrananda D, Piskorz AM, Moore EK, Morris J, Ahlborn LB, Mair R, Goranova T, Marass F, Heider K, Wan JM, Supernat A, Hudecova I, Gounaris I, Ros S, Jimenez-Linan M, Garcia-Corbacho J, Patel K, Østrup O, Murphy S, Eldridge MD, Gale D, Stewart GD, Burge J, Cooper WN, van der Heijden MS, Massie CE, Watts C, Corrie P, Pacey S, Brindle KM, Baird RD, Mau-Sørensen M, Parkinson CA, Smith CG, Brenton JD, Rosenfeld N |date=November 2018 |title=Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis |journal=Sci Transl Med |volume=10 |issue=466 |page= |doi=10.1126/scitranslmed.aat4921 |pmc=6483061 |pmid=30404863}}</ref>和较大片段（21 kb） <ref>{{Cite journal |vauthors=Gall TM, Belete S, Khanderia E, Frampton AE, Jiao LR |date=January 2019 |title=Circulating Tumor Cells and Cell-Free DNA in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma |journal=The American Journal of Pathology |volume=189 |issue=1 |page=71–81 |doi=10.1016/j.ajpath.2018.03.020 |pmid=30558725 |doi-access=free}}</ref>组成，并已被认为是准确的标记物[[前列腺癌]]和[[乳癌|乳腺癌]]的[[診斷 (工程)|诊断]]。 <ref name="pmid23509700">{{Cite journal |vauthors=Casadio V, Calistri D, Salvi S, Gunelli R, Carretta E, Amadori D, Silvestrini R, Zoli W |date=2013 |title=Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study |journal=Biomed Res Int |volume=2013 |issue= |page=270457 |doi=10.1155/2013/270457 |pmc=3586456 |pmid=23509700 |doi-access=free}}</ref>
'''游离DNA'''，有时称为'''游离核酸，'''可以指：胎儿游离DNA、游离肿瘤DNA、无细胞循环线粒体DNA等。游离核酸存在于细胞外，具有胞间通讯及免疫调节功能，贯穿机体生老病死各个过程，可依来源分为两种，外源游离核酸主要来自宿主体内感染或寄生，内源游离核酸主要来自细胞凋亡（apoptosis）等机体自身过程。


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游离核酸主要包含双链核DNA、线粒体DNA等，产生于各种疾病过程，与疾病进程关联密切，有望作为临床生物标志物以诊断细胞凋亡、组织损伤及炎症过程。在炎症、损伤及癌症组织临床样本中，疾病个体游离核酸浓度与健康个体差异显著，除了浓度，核酸片段所携带起源细胞特征，亦可用于临床诊断。母体血浆中游离胎儿核酸含有胎儿特异性甲基化水平，可作非侵入性产前诊断工具；肿瘤来源核酸具有肿瘤组织特异性甲基化状态，可用于癌症筛查及定位；器官移植后游离核酸可反映供体情况。血浆游离核酸与其来源组织亚细胞器结构、染色质结构、基因表达及核酸酶含量密切相关，分析核酸片段长度、序列及拓扑结构等可为炎症、疾病提供更多诊疗信息<ref>{{Cite journal |last=Nagy |first=Balint |date=2019-11-12 |title=Cell-Free Nucleic Acids |url=https://www.mdpi.com/1422-0067/20/22/5645 |journal=International Journal of Molecular Sciences |language=en |volume=20 |issue=22 |doi=10.3390/ijms20225645 |issn=1422-0067}}</ref>。
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== 来源 ==
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一般，细胞凋亡受机体严格调控，膜破裂前得到及时清除，完成良性反应过程；而凋亡过多或清除受阻下，细胞膜破裂时会释放游离核酸，激活机体先天免疫系统而诱发炎症反应。细胞坏死（necrosis）肇始于创伤及败血症等，该过程中细胞肿胀并迅速破裂，释放大量游离核酸等胞内成分；程序性坏死（pyroptosis）时，炎性细胞为应对病原体感染而释放游离核酸也都会激活炎症反应，参与炎症过程<ref>{{Cite journal |last=Duvvuri |first=Bhargavi |last2=Lood |first2=Christian |date=2019-03-19 |title=Cell-Free DNA as a Biomarker in Autoimmune Rheumatic Diseases |url=http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2019.00502 |journal=Frontiers in Immunology |volume=10 |doi=10.3389/fimmu.2019.00502 |issn=1664-3224}}</ref>。


一些研究证实了 cfDNA 起源于[[癌|癌症]]，并且 cfDNA 出现在晚期癌症患者的循环[[血浆]]和其他[[體液|体液]]中。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Teo YV, Capri M, Morsiani C, Pizza G, Faria AM, Franceschi C, Neretti N |date=February 2019 |title=Cell-free DNA as a biomarker of aging |journal=Aging Cell |volume=18 |issue=1 |page=e12890 |doi=10.1111/acel.12890 |pmc=6351822 |pmid=30575273}}</ref>
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生物体遭受感染或损伤时，中性粒细胞趋移至该部位，释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），其纤维网络中富含DNA和抗菌蛋白，可捕捉并消灭病原体。NETs释放过程类似程序性死亡（programmed cell death），又不同于一般细胞凋亡或者坏死，遂取医学术语中代表细胞死亡的词尾“-osis”，以及“NET”为此过程命名为“释网凋亡（NETosis）”。NETosis除中性粒细胞外，也发生于肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等细胞。NETosis过程中，NETs释放通常持续数小时，并最终导致中性粒细胞溶解，形成数天之后即受脱氧核糖核酸酶I（DNase I）或巨噬细胞清除，过程中所释放游离核酸、蛋白等易引起自身免疫反应甚至疾病。另外，游离核酸通常包裹于细胞外囊泡（extracellular vesicle）中，以逃避酶降解，延长炎症持续时间，而自身免疫疾病患者DNase I活性一般较低，本身核酸降解能力缓慢，更是雪上加霜<ref>{{Cite journal |last=Kubiritova |first=Zuzana |last2=Radvanszky |first2=Jan |last3=Gardlik |first3=Roman |date=2019-07-26 |title=Cell-Free Nucleic Acids and their Emerging Role in the Pathogenesis and Clinical Management of Inflammatory Bowel Disease |url=http://dx.doi.org/10.3390/ijms20153662 |journal=International Journal of Molecular Sciences |volume=20 |issue=15 |doi=10.3390/ijms20153662 |issn=1422-0067}}</ref><ref>{{Cite journal |last=Lo |first=Y. M. Dennis |last2=Han |first2=Diana S. C. |last3=Jiang |first3=Peiyong |last4=Chiu |first4=Rossa W. K. |date=2021-04-09 |title=Epigenetics, fragmentomics, and topology of cell-free DNA in liquid biopsies |url=http://dx.doi.org/10.1126/science.aaw3616 |journal=Science |volume=372 |issue=6538 |doi=10.1126/science.aaw3616 |issn=0036-8075}}</ref>。


cfDNA 释放到[[循环系统|血流]]中的原因有多种，包括细胞凋亡、坏死和 NETosis。在肿瘤发展过程中，它在血液中的积累迅速增加，这是由[[细胞凋亡|凋亡]]细胞和[[壞死|坏死]]细胞过度释放DNA引起的。[[外排體|外泌体内]]的主动分泌已经被讨论过，但仍不清楚这是否是 cfDNA 的相关或相对较小的来源。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Thakur ZH, Becker A, Matei I, Huang Y, Costa-Silva B |date=2014 |title=Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection |journal=Cell Research |volume=24 |issue=6 |page=766–9 |doi=10.1038/cr.2014.44 |pmc=4042169 |pmid=24710597}}</ref>
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== 作用 ==
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游离核酸主要包含双链核DNA、线粒体DNA等，产生于各种疾病过程，与疾病进程关联密切，有望作为临床生物标志物以诊断细胞凋亡、组织损伤及炎症过程。在炎症、损伤及癌症组织临床样本中，疾病个体游离核酸浓度与健康个体差异显著，除了浓度，核酸片段所携带起源细胞特征，亦可用于临床诊断。母体血浆中游离胎儿核酸含有胎儿特异性甲基化水平，可作非侵入性产前诊断工具；肿瘤来源核酸具有肿瘤组织特异性甲基化状态，可用于癌症筛查及定位；器官移植后游离核酸可反映供体情况。血浆游离核酸与其来源组织亚细胞器结构、染色质结构、基因表达及核酸酶含量密切相关，分析核酸片段长度、序列及拓扑结构等可为炎症、疾病提供更多诊疗信息<ref>{{Cite journal |last=Nagy |first=Balint |date=2019-11-12 |title=Cell-Free Nucleic Acids |url=http://dx.doi.org/10.3390/ijms20225645 |journal=International Journal of Molecular Sciences |volume=20 |issue=22 |doi=10.3390/ijms20225645 |issn=1422-0067}}</ref>。


cfDNA 主要以[[核小體|核小体]]形式循环，核小体是[[組織蛋白|组蛋白]]和DNA 的核复合物。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Roth C, Pantel K, Müller V, Rack B, Kasimir-Bauer S, Janni W, Schwarzenbach H |date=January 2011 |title=Apoptosis-related deregulation of proteolytic activities and high serum levels of circulating nucleosomes and DNA in blood correlate with breast cancer progression |journal=BMC Cancer |volume=11 |issue=1 |page=4 |doi=10.1186/1471-2407-11-4 |pmc=3024991 |pmid=21211028}}</ref> cfDNA 也可以在较短的大小范围内（例如 50bp）观察到，并且与调控元件相关。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Hudecova I, Smith CG, Hänsel-Hertsch R, Chilamakuri C, Morris JA, Vijayaraghavan A, Heider K, Chandrananda D, Cooper WN, Gale D, Garcia-Corbacho J, Pacey S, Baird R, Rosenfeld N, Mouliere F |date=2021 |title=Characteristics, origin, and potential for cancer diagnostics of ultrashort plasma cell-free DNA |journal=Genome Research |doi=10.1101/gr.275691.121 |pmid=34930798 |doi-access=free}}</ref>它们在[[癌症]]中经常非特异性升高，但对于监测细胞毒性[[癌症|癌症治疗]]可能更具有特异性，主要是为了早期评估治疗[[效能|效果]]。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Stoetzer OJ, Fersching DM, Salat C, Steinkohl O, Gabka CJ, Hamann U, Braun M, Feller AM, Heinemann V, Siegele B, Nagel D, Holdenrieder S |date=August 2013 |title=Prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients by circulating apoptotic biomarkers nucleosomes, DNAse, cytokeratin-18 fragments and survivin |journal=Cancer Letters |volume=336 |issue=1 |page=140–8 |doi=10.1016/j.canlet.2013.04.013 |pmid=23612068}}</ref>
== 促炎机理 ==

炎症过程源于先天免疫系统检测到相关分子模式，进而激活蛋白相互作用、基因表达调控以及细胞内外信号通路，其中以游离核酸为代表的内源性DAMP，可被模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）识别，激活免疫反应。游离核酸于细胞内主要经三种通路起作用：（1）TLR9通路：低甲基化游离核酸刺激TLR9，激活MyD88，释放核因子活化B细胞κ轻链增强子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）等活化核转录因子至细胞核，经干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRF）传导促进促炎细胞因子表达；（2）STING通路：环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）与核酸双链结合于细胞质，二聚后催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）及三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）两者合成第二信使——环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP），活化干扰素基因刺激基因（stimulator of interferon genes, STING）以激活自身免疫；（3）AIM2通路：黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）识别游离核酸 后与含有胱天蛋白酶募集域的凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）相互作用，募集胱天蛋白 酶原-1（pro-caspase-1），激活胱天蛋白酶-1（caspases-1）以诱导细胞焦亡<ref>{{Cite journal |last=Zinkova |first=Alzbeta |last2=Brynychova |first2=Iva |last3=Svacina |first3=Alexander |last4=Jirkovska |first4=Marie |last5=Korabecna |first5=Marie |date=2017-06-01 |title=Cell-free DNA from human plasma and serum differs in content of telomeric sequences and its ability to promote immune response |url=http://dx.doi.org/10.1038/s41598-017-02905-8 |journal=Scientific Reports |volume=7 |issue=1 |doi=10.1038/s41598-017-02905-8 |issn=2045-2322}}</ref>。
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== 历史 ==
游离[[核酸]]由 Mandel 和 Metais 于1948年首次发现<ref>{{Cite journal |vauthors=Mandel P, Metais P |date=February 1948 |title=Les Acides Nucléiques Du Plasma Sanguin Chez l'Homme |journal=Comptes Rendus des Séances de la Société de Biologie et de ses Filiales |volume=142 |issue=3–4 |page=241–3 |pmid=18875018}}</ref>后来发现患病患者[[血浆]]中cfDNA的水平显着升高。这一发现首先是在[[全身性紅斑狼瘡|系统性红斑狼疮]]患者中发现的<ref>{{Cite journal |vauthors=Tan EM, Schur PH, Carr RI, Kunkel HG |date=November 1966 |title=Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus |journal=The Journal of Clinical Investigation |volume=45 |issue=11 |page=1732–40 |doi=10.1172/jci105479 |pmc=292857 |pmid=4959277}}</ref> ，后来确定超过一半的癌症患者的 cfDNA 水平升高。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ |date=March 1977 |title=Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy |journal=Cancer Research |volume=37 |issue=3 |page=646–50 |pmid=837366}}</ref> cfDNA 的分子分析得出了一个重要发现，即[[癌症]]患者的血浆 DNA 含有肿瘤相关突变，可用于癌症诊断和随访。 <ref name="pmid 7918071">{{Cite journal |vauthors=Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M |date=April 1994 |title=Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia |journal=British Journal of Haematology |volume=86 |issue=4 |page=774–779 |doi=10.1111/j.1365-2141.1994.tb04828.x |pmid=7918071 |s2cid=26365875}}</ref> <ref>{{Cite journal |vauthors=Vasioukhin V, Stroun M, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Anker P |date=May 1994 |title=K-ras point mutations in the blood plasma DNA of patients with colorectal tumors |journal=Challenges of Modern Medicine: Biotechnology Today |volume=5 |page=141–150}}
</ref>从人体血浆中提取循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA，ctDNA) 的能力使无创[[癌症]]检测取得了巨大进步。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Yao SL |date=January 1994 |title=Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood |journal=Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention |volume=3 |issue=1 |page=67–71 |pmid=8118388}}</ref>最值得注意的是，它导致了现在所谓的液体活检。简而言之，液体[[活體組織檢查|活检]]利用血液中的生物标志物和[[癌细胞]]作为诊断癌症类型和阶段的手段。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Arneth B |date=May 2018 |title=Update on the types and usage of liquid biopsies in the clinical setting: a systematic review |journal=BMC Cancer |volume=18 |issue=1 |page=527 |doi=10.1186/s12885-018-4433-3 |pmc=5935950 |pmid=29728089}}</ref>这种类型的活检是非侵入性的，可以进行常规临床筛查，这对于确定初始治疗后的癌症复发非常重要。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Babayan A, Pantel K |date=March 2018 |title=Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer |journal=Genome Medicine |volume=10 |issue=1 |page=21 |doi=10.1186/s13073-018-0533-6 |pmc=5861602 |pmid=29558971}}</ref>

== cfDNA 的不同来源 ==
cfDNA 的细胞内来源，例如来自[[细胞核]]或[[線粒體|线粒体]]，也可以影响 cfDNA 的炎症潜力。 mtDNA 是一种有效的[[炎症|炎症触发因素]]。 <ref name="Lood 146–153">{{Cite journal |vauthors=Lood C, Blanco LP, Purmalek MM, Carmona-Rivera C, De Ravin SS, Smith CK, Malech HL, Ledbetter JA, Elkon KB, Kaplan MJ |date=February 2016 |title=Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease |journal=Nature Medicine |volume=22 |issue=2 |page=146–53 |doi=10.1038/nm.4027 |pmc=4742415 |pmid=26779811}}</ref> mtDNA由于其[[原核生物|原核]]起源，具有许多与[[细菌]][[脱氧核糖核酸|DNA]]相似的特征，包括存在相对较高含量的未甲基化[[CpG位点|CpG]]基序，这在核DNA中很少观察到。 <ref name="pmid3892535">{{Cite journal |vauthors=Yang D, Oyaizu Y, Oyaizu H, Olsen GJ, Woese CR |date=July 1985 |title=Mitochondrial origins |journal=Proc Natl Acad Sci U S A |volume=82 |issue=13 |page=4443–7 |doi=10.1073/pnas.82.13.4443 |pmc=391117 |pmid=3892535 |doi-access=free}}</ref>未甲基化的[[CpG位点|CpG]]基序特别重要，因为[[TLR9]] （唯一的内溶酶体 DNA 感应受体）对未甲基化的[[CpG位点|CpG]] [[脱氧核糖核酸|DNA]]具有独特的特异性。 [[线粒体DNA|mtDNA]]被证明可通过[[TLR9]]参与激活[[中性粒细胞]]<ref>{{Cite journal |vauthors=Zhang Q, Raoof M, Chen Y, Sumi Y, Sursal T, Junger W, Brohi K, Itagaki K, Hauser CJ |date=March 2010 |title=Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury |journal=Nature |volume=464 |issue=7285 |page=104–7 |bibcode=2010Natur.464..104Z |doi=10.1038/nature08780 |pmc=2843437 |pmid=20203610}}</ref>除非与载体[[蛋白质|蛋白]]偶联， [[线粒体DNA|mtDNA]] （而非核 DNA）可被视为通过[[TLR9]]诱导促炎症的危险相关分子模式。 <ref name=":0">{{Cite journal |vauthors=Collins LV, Hajizadeh S, Holme E, Jonsson IM, Tarkowski A |date=June 2004 |title=Endogenously oxidized mitochondrial DNA induces in vivo and in vitro inflammatory responses |journal=Journal of Leukocyte Biology |volume=75 |issue=6 |page=995–1000 |doi=10.1189/jlb.0703328 |pmid=14982943 |s2cid=6180899}}</ref>柯林斯等人。据报道，关节内注射[[线粒体DNA|mtDNA]]可诱发体内关节炎，提出[[线粒体DNA|mtDNA]]挤出在 RA[[疾病]]发病机制中的直接作用。 <ref name=":0" />

与核 DNA 相比，[[线粒体DNA|线粒体]][[脱氧核糖核酸|DNA]]的特点是 8-OHdG 基础水平升高，这是氧化损伤的标志。 mtDNA 中高含量的[[氧化还原反应|氧化]]损伤归因于[[线粒体DNA|mtDNA]]与 ROS 非常接近，并且[[脱氧核糖核酸|DNA]]修复机制相对低效，可导致 DNA 损伤的积累。 <ref name="pmid1238079">{{Cite journal |vauthors=Clayton DA, Doda JN, Friedberg EC |date=1975 |title=Absence of a pyrimidine dimer repair mechanism for mitochondrial DNA in mouse and human cells |journal=Basic Life Sci |volume=5B |issue= |page=589–91 |doi=10.1007/978-1-4684-2898-8_26 |pmid=1238079}}</ref>

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一般，细胞凋亡受机体严格调控，膜破裂前得到及时清除，完成良性反应过程；而凋亡过多或清除受阻下，细胞膜破裂时会释放游离核酸，激活机体先天免疫系统而诱发炎症反应。细胞坏死（necrosis）肇始于创伤及败血症等，该过程中细胞肿胀并迅速破裂，释放大量游离核酸等胞内成分；程序性坏死（pyroptosis）时，炎性细胞为应对病原体感染而释放游离核酸也都会激活炎症反应，参与炎症过程<ref>{{Cite journal |last=Duvvuri |first=Bhargavi |last2=Lood |first2=Christian |date=2019-03-19 |title=Cell-Free DNA as a Biomarker in Autoimmune Rheumatic Diseases |url=https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2019.00502/full |journal=Frontiers in Immunology |volume=10 |doi=10.3389/fimmu.2019.00502 |issn=1664-3224}}</ref>。

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生物体遭受感染或损伤时，中性粒细胞趋移至该部位，释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），其纤维网络中富含DNA和抗菌蛋白，可捕捉并消灭病原体。NETs释放过程类似程序性死亡（programmed cell death），又不同于一般细胞凋亡或者坏死，遂取医学术语中代表细胞死亡的词尾“-osis”，以及“NET”为此过程命名为“释网凋亡（NETosis）”。NETosis除中性粒细胞外，也发生于肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等细胞。NETosis过程中，NETs释放通常持续数小时，并最终导致中性粒细胞溶解，形成数天之后即受脱氧核糖核酸酶I（DNase I）或巨噬细胞清除，过程中所释放游离核酸、蛋白等易引起自身免疫反应甚至疾病。另外，游离核酸通常包裹于细胞外囊泡（extracellular vesicle）中，以逃避酶降解，延长炎症持续时间，而自身免疫疾病患者DNase I活性一般较低，本身核酸降解能力缓慢，更是雪上加霜<ref>{{Cite journal |last=Kubiritova |first=Zuzana |last2=Radvanszky |first2=Jan |last3=Gardlik |first3=Roman |date=2019-07-26 |title=Cell-Free Nucleic Acids and their Emerging Role in the Pathogenesis and Clinical Management of Inflammatory Bowel Disease |url=https://www.mdpi.com/1422-0067/20/15/3662 |journal=International Journal of Molecular Sciences |language=en |volume=20 |issue=15 |doi=10.3390/ijms20153662 |issn=1422-0067}}</ref><ref>{{Cite journal |last=Lo |first=Y. M. Dennis |last2=Han |first2=Diana S. C. |last3=Jiang |first3=Peiyong |last4=Chiu |first4=Rossa W. K. |date=2021-04-09 |title=Epigenetics, fragmentomics, and topology of cell-free DNA in liquid biopsies |url=https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaw3616 |journal=Science |language=en |volume=372 |issue=6538 |doi=10.1126/science.aaw3616 |issn=0036-8075}}</ref>。

他们表明，NETosis 期间的氧化爆发可以氧化[[线粒体DNA|mtDNA]] ，并且释放的氧化[[线粒体DNA|mtDNA]]本身或与TFAM复合，可以产生 I 型 IFN 的显着诱导。 <ref name="Lood 146–153">{{Cite journal |vauthors=Lood C, Blanco LP, Purmalek MM, Carmona-Rivera C, De Ravin SS, Smith CK, Malech HL, Ledbetter JA, Elkon KB, Kaplan MJ |date=February 2016 |title=Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease |journal=Nature Medicine |volume=22 |issue=2 |page=146–53 |doi=10.1038/nm.4027 |pmc=4742415 |pmid=26779811}}<cite class="citation journal cs1" data-ve-ignore="true" id="CITEREFLoodBlancoPurmalekCarmona-Rivera2016">Lood C, Blanco LP, Purmalek MM, Carmona-Rivera C, De Ravin SS, Smith CK, Malech HL, Ledbetter JA, Elkon KB, Kaplan MJ (February 2016). [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4742415 "Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease"]. ''Nature Medicine''. '''22''' (2): 146–53. [[DOI|doi]]:[[doi:10.1038/nm.4027|10.1038/nm.4027]]. [[PubMed Central|PMC]]&nbsp;<span class="cs1-lock-free" title="Freely accessible">[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4742415 4742415]</span>. [[PubMed|PMID]]&nbsp;[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26779811 26779811].</cite></ref>程序性细胞死亡过程中产生的氧化[[线粒体DNA|mtDNA]]不仅会激活[[TLR9]] ，而且还与 NRLP3 炎症小体结合，导致促炎[[细胞因子]]、 IL-1β和IL-18的产生。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Shimada K, Crother TR, Karlin J, Dagvadorj J, Chiba N, Chen S, Ramanujan VK, Wolf AJ, Vergnes L, Ojcius DM, Rentsendorj A, Vargas M, Guerrero C, Wang Y, Fitzgerald KA, Underhill DM, Town T, Arditi M |date=March 2012 |title=Oxidized mitochondrial DNA activates the NLRP3 inflammasome during apoptosis |journal=Immunity |volume=36 |issue=3 |page=401–14 |doi=10.1016/j.immuni.2012.01.009 |pmc=3312986 |pmid=22342844}}</ref> [[线粒体DNA|MtDNA]]还可被环GMP -AMP 合酶 (cGAS) 识别，cGAS 是一种胞质[[脱氧核糖核酸|dsDNA]]传感器，可启动 STING-IRF3 依赖性途径，进而协调 I 型 IFN 的产生。 <ref name="Duvvuri Lood" /> <ref>{{Cite journal |vauthors=West AP, Khoury-Hanold W, Staron M, Tal MC, Pineda CM, Lang SM, Bestwick M, Duguay BA, Raimundo N, MacDuff DA, Kaech SM, Smiley JR, Means RE, Iwasaki A, Shadel GS |date=April 2015 |title=Mitochondrial DNA stress primes the antiviral innate immune response |journal=Nature |volume=520 |issue=7548 |page=553–7 |bibcode=2015Natur.520..553W |doi=10.1038/nature14156 |pmc=4409480 |pmid=25642965}}</ref>

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== 方法 ==

=== 收集与纯化 ===
cfDNA 纯化很容易因纯化过程中血细胞破裂而受到污染。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Lui YY, Chik KW, Chiu RW, Ho CY, Lam CW, Lo YM |date=March 2002 |title=Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation |journal=Clinical Chemistry |volume=48 |issue=3 |page=421–7 |doi=10.1093/clinchem/48.3.421 |pmid=11861434 |doi-access=free}}</ref>因此，不同的纯化方法可能会导致 cfDNA 提取率显着不同。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Page K, Guttery DS, Zahra N, Primrose L, Elshaw SR, Pringle JH, Blighe K, Marchese SD, Hills A, Woodley L, Stebbing J, Coombes RC, Shaw JA |date=2013-10-18 |title=Influence of plasma processing on recovery and analysis of circulating nucleic acids |journal=PLOS ONE |volume=8 |issue=10 |page=e77963 |bibcode=2013PLoSO...877963P |doi=10.1371/journal.pone.0077963 |pmc=3799744 |pmid=24205045 |doi-access=free}}</ref> <ref>{{Cite journal |vauthors=Barták BK, Kalmár A, Galamb O, Wichmann B, Nagy ZB, Tulassay Z, Dank M, Igaz P, Molnár B |date=January 2018 |title=Blood Collection and Cell-Free DNA Isolation Methods Influence the Sensitivity of Liquid Biopsy Analysis for Colorectal Cancer Detection |journal=Pathology & Oncology Research |volume=25 |issue=3 |page=915–923 |doi=10.1007/s12253-018-0382-z |pmid=29374860 |s2cid=24629831}}</ref>目前，典型的纯化方法包括通过[[静脉穿刺]]收集血液、离心沉淀细胞以及从血浆中提取 cfDNA。从血浆中提取 cfDNA 的具体方法取决于所需的方案。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Pérez-Barrios C, Nieto-Alcolado I, Torrente M, Jiménez-Sánchez C, Calvo V, Gutierrez-Sanz L, Palka M, Donoso-Navarro E, Provencio M, Romero A |date=December 2016 |title=Comparison of methods for circulating cell-free DNA isolation using blood from cancer patients: impact on biomarker testing |journal=Translational Lung Cancer Research |volume=5 |issue=6 |page=665–672 |doi=10.21037/tlcr.2016.12.03 |pmc=5233878 |pmid=28149760}}</ref>

=== cfDNA 分析 ===

==== 聚合酶链式反应 ====
一般来说，cfDNA中特定DNA序列的检测可以通过两种方式完成；对血液中存在的所有 cfDNA 进行序列特异性检测（基于[[聚合酶链式反应|PCR]] ）和一般基因组分析（ [[DNA測序|DNA 测序]]）。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Volik S, Alcaide M, Morin RD, Collins C |date=October 2016 |title=Cell-free DNA (cfDNA): Clinical Significance and Utility in Cancer Shaped By Emerging Technologies |url=http://mcr.aacrjournals.org/content/14/10/898 |journal=Molecular Cancer Research |volume=14 |issue=10 |page=898–908 |doi=10.1158/1541-7786.MCR-16-0044 |pmid=27422709 |doi-access=free}}</ref>含有来自肿瘤细胞的 DNA 的 cfDNA 的存在最初是通过对提取的 cfDNA 中的突变基因进行 PCR 扩增来表征的。 <ref name="pmid 7918071">{{Cite journal |vauthors=Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M |date=April 1994 |title=Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia |journal=British Journal of Haematology |volume=86 |issue=4 |page=774–779 |doi=10.1111/j.1365-2141.1994.tb04828.x |pmid=7918071 |s2cid=26365875}}<cite class="citation journal cs1" data-ve-ignore="true" id="CITEREFVasioukhinAnkerMauriceLyautey1994">Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M (April 1994). "Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia". ''British Journal of Haematology''. '''86''' (4): 774–779. [[DOI|doi]]:[[doi:10.1111/j.1365-2141.1994.tb04828.x|10.1111/j.1365-2141.1994.tb04828.x]]. [[PubMed|PMID]]&nbsp;[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7918071 7918071]. [[语义学者|S2CID]]&nbsp;[https://api.semanticscholar.org/CorpusID:26365875 26365875].</cite></ref>基于 PCR 的 cfDNA 分析通常依赖于[[即時聚合酶鏈式反應|qPCR]]和数字 PCR的分析性质。这两种技术对于检测有限数量的热点突变来说都是灵敏且具有成本效益的。因此，基于[[聚合酶链式反应|PCR 的]]检测方法仍然是 cfDNA 检测中非常重要的工具。该方法的局限性在于无法检测 ctDNA 中存在的较大结构变异，因此大规模并行下一代测序也用于确定 cfDNA 中的 ctDNA 含量

==== 大规模并行测序 ====
大规模并行测序(MPS) 允许对 cfDNA 进行深度测序。需要这种深度测序来检测血浆中低浓度的突变体 ctDNA。突变 cfDNA 分析通常使用两种主要测序技术： PCR 扩增子测序<ref>{{Cite journal |vauthors=Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, Gale D, Tsui DW, Kaper F, Dawson SJ, Piskorz AM, Jimenez-Linan M, Bentley D, Hadfield J, May AP, Caldas C, Brenton JD, Rosenfeld N |date=May 2012 |title=Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA |journal=Science Translational Medicine |volume=4 |issue=136 |page=136ra68 |doi=10.1126/scitranslmed.3003726 |pmid=22649089 |s2cid=34723244}}</ref>和混合捕获测序。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW, Alizadeh AA, Diehn M |date=May 2014 |title=An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage |journal=Nature Medicine |volume=20 |issue=5 |page=548–54 |doi=10.1038/nm.3519 |pmc=4016134 |pmid=24705333}}</ref>其他形式的遗传改变可以使用 ctDNA 进行分析（例如体细胞拷贝数改变或遗传重排）。这里，主要使用基于非靶向测序的方法，例如WGS或低覆盖度WGS。

== cfDNA 与疾病 ==

=== 癌症 ===
大多数 cfDNA 研究都集中在源自癌症的 DNA ( ctDNA )。简而言之，癌细胞的 DNA 通过细胞死亡、分泌或其他未知机制释放。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K |date=June 2011 |title=Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients |journal=Nature Reviews. Cancer |volume=11 |issue=6 |page=426–37 |doi=10.1038/nrc3066 |pmid=21562580 |s2cid=6061607}}</ref>循环中肿瘤细胞释放的 cfDNA 分数受到肿瘤大小以及肿瘤阶段和类型的影响。早期癌症和脑肿瘤是液体活检最难检测的疾病之一。 <ref>{{Cite journal |last=van der Pol Y, Mouliere F |year=2019 |title=Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA. |journal=Cancer Cell |volume=36 |issue=4 |page=350–368 |doi=10.1016/j.ccell.2019.09.003 |pmid=31614115 |doi-access=free}}</ref> <ref name="pmid34291583">{{Cite journal |vauthors=Mouliere F, Smith CG, Heider K, Su J, van der Pol Y, Thompson M, Morris J, Wan JM, Chandrananda D, Hadfield J, Grzelak M, Hudecova I, Couturier DL, Cooper W, Zhao H, Gale D, Eldridge M, Watts C, Brindle K, Rosenfeld N, Mair R |date=August 2021 |title=Fragmentation patterns and personalized sequencing of cell-free DNA in urine and plasma of glioma patients |journal=EMBO Mol Med |volume=13 |issue=8 |page=e12881 |doi=10.15252/emmm.202012881 |pmc=8350897 |pmid=34291583 |doi-access=free}}</ref> <ref>{{Cite journal |vauthors=Eibl RH, Schneemann M |date=August 2022 |title=Cell-free DNA as a biomarker in cancer |journal=Extracell Vesicles Circ Nucleic Acid |volume=3 |page=178-98 |doi=10.20517/evcna.2022.20 |doi-access=free}}</ref>

=== 创伤 ===
急性钝性创伤<ref>{{Cite journal |vauthors=Lo YM, Rainer TH, Chan LY, Hjelm NM, Cocks RA |date=March 2000 |title=Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients |journal=Clinical Chemistry |volume=46 |issue=3 |page=319–23 |doi=10.1093/clinchem/46.3.319 |pmid=10702517 |doi-access=free}}</ref>和烧伤患者中已检测到 cfDNA 升高。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Chiu TW, Young R, Chan LY, Burd A, Lo DY |date=2006 |title=Plasma cell-free DNA as an indicator of severity of injury in burn patients |journal=Clinical Chemistry and Laboratory Medicine |volume=44 |issue=1 |page=13–7 |doi=10.1515/CCLM.2006.003 |pmid=16375578 |s2cid=37876738}}</ref>在这两种情况下，血浆中的 cfDNA 浓度与损伤的严重程度以及患者的结果相关。

=== 败血症 ===
研究表明， [[加護病房|ICU]]患者血浆中 cfDNA 的增加是[[敗血症|脓毒症]]发病的一个指标。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Rhodes A, Wort SJ, Thomas H, Collinson P, Bennett ED |date=2006 |title=Plasma DNA concentration as a predictor of mortality and sepsis in critically ill patients |journal=Critical Care |volume=10 |issue=2 |page=R60 |doi=10.1186/cc4894 |pmc=1550922 |pmid=16613611}}</ref> <ref>{{Cite journal |vauthors=Martins GA, Kawamura MT, Carvalho M |date=April 2000 |title=Detection of DNA in the plasma of septic patients |journal=Annals of the New York Academy of Sciences |volume=906 |issue=1 |page=134–40 |bibcode=2000NYASA.906..134M |doi=10.1111/j.1749-6632.2000.tb06603.x |pmid=10818609 |s2cid=36198236}}</ref>由于 ICU 患者脓毒症的严重程度，可能需要进行进一步测试以确定 cfDNA 作为脓毒症风险生物标志物的功效范围。 <ref name=":12">{{Cite journal |vauthors=Butt AN, Swaminathan R |date=August 2008 |title=Overview of circulating nucleic acids in plasma/serum |journal=Annals of the New York Academy of Sciences |volume=1137 |issue=1 |page=236–42 |bibcode=2008NYASA1137..236B |doi=10.1196/annals.1448.002 |pmid=18837954 |s2cid=34380267}}<cite class="citation journal cs1" data-ve-ignore="true" id="CITEREFButtSwaminathan2008">Butt AN, Swaminathan R (August 2008). "Overview of circulating nucleic acids in plasma/serum". ''Annals of the New York Academy of Sciences''. '''1137''' (1): 236–42. [[Bibcode]]:[https://ui.adsabs.harvard.edu/abs/2008NYASA1137..236B 2008NYASA1137..236B]. [[DOI|doi]]:[[doi:10.1196/annals.1448.002|10.1196/annals.1448.002]]. [[PubMed|PMID]]&nbsp;[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18837954 18837954]. [[语义学者|S2CID]]&nbsp;[https://api.semanticscholar.org/CorpusID:34380267 34380267].</cite></ref>

=== 心肌梗塞 ===
显示出[[心肌梗死|心肌梗塞]]症状的患者的 cfDNA 水平升高。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Chang CP, Chia RH, Wu TL, Tsao KC, Sun CF, Wu JT |date=January 2003 |title=Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction |journal=Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry |volume=327 |issue=1–2 |page=95–101 |doi=10.1016/S0009-8981(02)00337-6 |pmid=12482623}}</ref>这种升高与患者两年内额外心脏问题甚至死亡率的结果相关。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Rainer TH, Lam NY, Man CY, Chiu RW, Woo KS, Lo YM |date=June 2006 |title=Plasma beta-globin DNA as a prognostic marker in chest pain patients |journal=Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry |volume=368 |issue=1–2 |page=110–3 |doi=10.1016/j.cca.2005.12.021 |pmid=16480967}}</ref>

=== 移植物排斥反应 ===
外源 cfDNA 已被证明存在于实体器官移植患者的血浆中。该 cfDNA 来自移植器官，称为 dd-cfDNA（供体来源的无细胞 DNA）。 DdcfDNA 值在移植手术后最初会出现峰值 (>5%)，其值在很大程度上取决于移植的器官，通常会在一周内下降 (<0.5%)。 <ref name=":02">{{Cite journal |vauthors=Beck J, Oellerich M, Schulz U, Schauerte V, Reinhard L, Fuchs U, Knabbe C, Zittermann A, Olbricht C, Gummert JF, Shipkova M, Birschmann I, Wieland E, Schütz E |date=October 2015 |title=Donor-Derived Cell-Free DNA Is a Novel Universal Biomarker for Allograft Rejection in Solid Organ Transplantation |journal=Transplantation Proceedings |volume=47 |issue=8 |page=2400–3 |doi=10.1016/j.transproceed.2015.08.035 |pmid=26518940}}</ref>如果宿主身体排斥移植器官，则血液（血浆）中的 ddcfDNA 浓度将升至比无并发症者高 5 倍以上的水平。 ddcfDNA 的这种增加可以在任何其他临床或生化并发症迹象之前检测到。 <ref name=":02" />除了血浆中的ddcfDNA外，一些研究还关注ddcfDNA通过尿液的排泄。这在肾同种异体移植中特别令人感兴趣。当使用靶向下一代测序测量 ddcfDNA 时，使用群体特异性全基因组[[單核苷酸多態性|SNP]]组合进行检测。 <ref name=":03">{{Cite journal |vauthors=Grskovic M |date=November 2016 |title=Validation of a Clinical-Grade Assay to Measure Donor-Derived Cell-Free DNA in Solid Organ Transplant Recipients |journal=The Journal of Molecular Diagnostics |volume=18 |issue=6 |page=890–902 |doi=10.1016/j.jmoldx.2016.07.003 |pmid=27727019 |doi-access=free}}</ref>在[[Library preparation|文库制备过程]]中，在NGS之前将条形码附加到连接的接头上，可以实现绝对 ddcfDNA 定量，而无需事先进行供体基因分型。如果将 cfDNA 拷贝的绝对数量与来自受者的 ddcfDNA 相对于 cfDNA 的分数结合起来，以确定同种异体移植物是否被排斥，这已被证明可以提供额外的临床益处。 <ref name=":03" />


== 未来发展方向 ==
[[File:ELISA_diretto_e_sandwich.png|thumb]]
cfDNA 提供了一种快速、简单、非侵入性和重复性的采样方法。这些生物学特征和采样的技术可行性相结合，将 cfDNA 定位为具有巨大用途的潜在[[生物标记|生物标志物]]，例如用于自身[[自體免疫性疾病|免疫性]][[风湿|风湿病]]和肿瘤。它还提供了一种潜在的生物标志物，与侵入性组织活检相比，它具有自身的优势，可以作为检测移植排斥和免疫抑制优化的定量措施。然而，该方法在样本类型（血浆/血清/滑液/尿液）、样本采集/处理方法、游离或细胞表面结合 DNA、cfDNA 提取和 cfDNA 定量以及呈现和解释方面缺乏统一性定量 cfDNA 结果。

cfDNA通过荧光方法定量，例如PicoGreen染色和紫外光谱法，更灵敏的是重复元件或看家[[基因]]的定量聚合酶链反应（ [[聚合酶链式反应|PCR]] ；SYBR Green或TaqMan），或深度测序方法。循环核小体是[[染色质]]中 DNA 组织的主要重复单位，可通过[[酶|酶联]]免疫吸附测定 ( [[酶联免疫吸附测定|ELISA]] ) 进行定量。 <ref>{{Cite journal |vauthors=Pinzani P, Salvianti F, Pazzagli M, Orlando C |date=April 2010 |title=Circulating nucleic acids in cancer and pregnancy |journal=Methods |volume=50 |issue=4 |page=302–7 |doi=10.1016/j.ymeth.2010.02.004 |pmid=20146940}}</ref>

== 数据库 ==
[https://generegulation.org/nucposdb/ NucPosDB：''体''内核小体定位和游离 DNA 核小体的数据库]


== 参考 ==
== 参考 ==
{{Reflist}}
[[Category:DNA]]
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2023年7月3日 (一) 07:49的版本

循环游离DNA（cfDNA） （也称为游离DNA，有时称为游离核酸）是释放到血浆、尿液、脑脊液等体液中的降解DNA片段。 cfDNA 片段的典型大小反映了染色体颗粒 (~165bp) 以及多个核小体，可保护 DNA 免受凋亡核酸酶的消化。[1]游离核酸存在于细胞外，具有胞间通讯及免疫调节功能，贯穿机体生老病死各个过程，可用于描述在体液中自由循环的各种形式的DNA，包括循环肿瘤DNA（ctDNA） 、无细胞线粒体DNA （ccf mtDNA）、无细胞胎儿DNA（cffDNA）和供体来源的细胞DNA (dd-cfDNA)。 [2]在癌症中，尤其是在晚期疾病中，观察到 cfDNA 水平升高。 [3]有證據表明，隨著年齡的增長，cfDNA 的循環變得越來越頻繁。 [4] cfDNA 已被证明是除癌症和胎儿医学之外的多种疾病的有用生物标志物。这包括但不限于创伤、败血症、无菌性炎症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病和镰状细胞病。 [5] cfDNA 主要是一種雙鏈細胞外 DNA 分子，由小片段（50 至 200 bp ） [6] [7]和较大片段（21 kb） [8]组成，并已被认为是准确的标记物前列腺癌和乳腺癌的诊断。 [9]

游离核酸主要包含双链核DNA、线粒体DNA等，产生于各种疾病过程，与疾病进程关联密切，有望作为临床生物标志物以诊断细胞凋亡、组织损伤及炎症过程。在炎症、损伤及癌症组织临床样本中，疾病个体游离核酸浓度与健康个体差异显著，除了浓度，核酸片段所携带起源细胞特征，亦可用于临床诊断。母体血浆中游离胎儿核酸含有胎儿特异性甲基化水平，可作非侵入性产前诊断工具；肿瘤来源核酸具有肿瘤组织特异性甲基化状态，可用于癌症筛查及定位；器官移植后游离核酸可反映供体情况。血浆游离核酸与其来源组织亚细胞器结构、染色质结构、基因表达及核酸酶含量密切相关，分析核酸片段长度、序列及拓扑结构等可为炎症、疾病提供更多诊疗信息[10]。

一些研究证实了 cfDNA 起源于癌症，并且 cfDNA 出现在晚期癌症患者的循环血浆和其他体液中。 [11]

cfDNA 释放到血流中的原因有多种，包括细胞凋亡、坏死和 NETosis。在肿瘤发展过程中，它在血液中的积累迅速增加，这是由凋亡细胞和坏死细胞过度释放DNA引起的。外泌体内的主动分泌已经被讨论过，但仍不清楚这是否是 cfDNA 的相关或相对较小的来源。 [12]

cfDNA 主要以核小体形式循环，核小体是组蛋白和DNA 的核复合物。 [13] cfDNA 也可以在较短的大小范围内（例如 50bp）观察到，并且与调控元件相关。 [14]它们在癌症中经常非特异性升高，但对于监测细胞毒性癌症治疗可能更具有特异性，主要是为了早期评估治疗效果。 [15]

历史

游离核酸由 Mandel 和 Metais 于1948年首次发现[16]后来发现患病患者血浆中cfDNA的水平显着升高。这一发现首先是在系统性红斑狼疮患者中发现的[17] ，后来确定超过一半的癌症患者的 cfDNA 水平升高。 [18] cfDNA 的分子分析得出了一个重要发现，即癌症患者的血浆 DNA 含有肿瘤相关突变，可用于癌症诊断和随访。 [19] [20]从人体血浆中提取循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA，ctDNA) 的能力使无创癌症检测取得了巨大进步。 [21]最值得注意的是，它导致了现在所谓的液体活检。简而言之，液体活检利用血液中的生物标志物和癌细胞作为诊断癌症类型和阶段的手段。 [22]这种类型的活检是非侵入性的，可以进行常规临床筛查，这对于确定初始治疗后的癌症复发非常重要。 [23]

cfDNA 的不同来源

cfDNA 的细胞内来源，例如来自细胞核或线粒体，也可以影响 cfDNA 的炎症潜力。 mtDNA 是一种有效的炎症触发因素。 [24] mtDNA由于其原核起源，具有许多与细菌DNA相似的特征，包括存在相对较高含量的未甲基化CpG基序，这在核DNA中很少观察到。 [25]未甲基化的CpG基序特别重要，因为TLR9 （唯一的内溶酶体 DNA 感应受体）对未甲基化的CpG DNA具有独特的特异性。 mtDNA被证明可通过TLR9参与激活中性粒细胞[26]除非与载体蛋白偶联， mtDNA （而非核 DNA）可被视为通过TLR9诱导促炎症的危险相关分子模式。 [27]柯林斯等人。据报道，关节内注射mtDNA可诱发体内关节炎，提出mtDNA挤出在 RA疾病发病机制中的直接作用。 [27]

与核 DNA 相比，线粒体DNA的特点是 8-OHdG 基础水平升高，这是氧化损伤的标志。 mtDNA 中高含量的氧化损伤归因于mtDNA与 ROS 非常接近，并且DNA修复机制相对低效，可导致 DNA 损伤的积累。 [28]

一般，细胞凋亡受机体严格调控，膜破裂前得到及时清除，完成良性反应过程；而凋亡过多或清除受阻下，细胞膜破裂时会释放游离核酸，激活机体先天免疫系统而诱发炎症反应。细胞坏死（necrosis）肇始于创伤及败血症等，该过程中细胞肿胀并迅速破裂，释放大量游离核酸等胞内成分；程序性坏死（pyroptosis）时，炎性细胞为应对病原体感染而释放游离核酸也都会激活炎症反应，参与炎症过程[29]。

生物体遭受感染或损伤时，中性粒细胞趋移至该部位，释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），其纤维网络中富含DNA和抗菌蛋白，可捕捉并消灭病原体。NETs释放过程类似程序性死亡（programmed cell death），又不同于一般细胞凋亡或者坏死，遂取医学术语中代表细胞死亡的词尾“-osis”，以及“NET”为此过程命名为“释网凋亡（NETosis）”。NETosis除中性粒细胞外，也发生于肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞等细胞。NETosis过程中，NETs释放通常持续数小时，并最终导致中性粒细胞溶解，形成数天之后即受脱氧核糖核酸酶I（DNase I）或巨噬细胞清除，过程中所释放游离核酸、蛋白等易引起自身免疫反应甚至疾病。另外，游离核酸通常包裹于细胞外囊泡（extracellular vesicle）中，以逃避酶降解，延长炎症持续时间，而自身免疫疾病患者DNase I活性一般较低，本身核酸降解能力缓慢，更是雪上加霜[30][31]。

他们表明，NETosis 期间的氧化爆发可以氧化mtDNA ，并且释放的氧化mtDNA本身或与TFAM复合，可以产生 I 型 IFN 的显着诱导。 [24]程序性细胞死亡过程中产生的氧化mtDNA不仅会激活TLR9 ，而且还与 NRLP3 炎症小体结合，导致促炎细胞因子、 IL-1β和IL-18的产生。 [32] MtDNA还可被环GMP -AMP 合酶 (cGAS) 识别，cGAS 是一种胞质dsDNA传感器，可启动 STING-IRF3 依赖性途径，进而协调 I 型 IFN 的产生。 [33] [34]

方法

收集与纯化

cfDNA 纯化很容易因纯化过程中血细胞破裂而受到污染。 [35]因此，不同的纯化方法可能会导致 cfDNA 提取率显着不同。 [36] [37]目前，典型的纯化方法包括通过静脉穿刺收集血液、离心沉淀细胞以及从血浆中提取 cfDNA。从血浆中提取 cfDNA 的具体方法取决于所需的方案。 [38]

cfDNA 分析

聚合酶链式反应

一般来说，cfDNA中特定DNA序列的检测可以通过两种方式完成；对血液中存在的所有 cfDNA 进行序列特异性检测（基于PCR ）和一般基因组分析（ DNA 测序）。 [39]含有来自肿瘤细胞的 DNA 的 cfDNA 的存在最初是通过对提取的 cfDNA 中的突变基因进行 PCR 扩增来表征的。 [19]基于 PCR 的 cfDNA 分析通常依赖于qPCR和数字 PCR的分析性质。这两种技术对于检测有限数量的热点突变来说都是灵敏且具有成本效益的。因此，基于PCR 的检测方法仍然是 cfDNA 检测中非常重要的工具。该方法的局限性在于无法检测 ctDNA 中存在的较大结构变异，因此大规模并行下一代测序也用于确定 cfDNA 中的 ctDNA 含量

大规模并行测序

大规模并行测序(MPS) 允许对 cfDNA 进行深度测序。需要这种深度测序来检测血浆中低浓度的突变体 ctDNA。突变 cfDNA 分析通常使用两种主要测序技术： PCR 扩增子测序[40]和混合捕获测序。 [41]其他形式的遗传改变可以使用 ctDNA 进行分析（例如体细胞拷贝数改变或遗传重排）。这里，主要使用基于非靶向测序的方法，例如WGS或低覆盖度WGS。

cfDNA 与疾病

癌症

大多数 cfDNA 研究都集中在源自癌症的 DNA ( ctDNA )。简而言之，癌细胞的 DNA 通过细胞死亡、分泌或其他未知机制释放。 [42]循环中肿瘤细胞释放的 cfDNA 分数受到肿瘤大小以及肿瘤阶段和类型的影响。早期癌症和脑肿瘤是液体活检最难检测的疾病之一。 [43] [44] [45]

创伤

急性钝性创伤[46]和烧伤患者中已检测到 cfDNA 升高。 [47]在这两种情况下，血浆中的 cfDNA 浓度与损伤的严重程度以及患者的结果相关。

败血症

研究表明， ICU患者血浆中 cfDNA 的增加是脓毒症发病的一个指标。 [48] [49]由于 ICU 患者脓毒症的严重程度，可能需要进行进一步测试以确定 cfDNA 作为脓毒症风险生物标志物的功效范围。 [5]

心肌梗塞

显示出心肌梗塞症状的患者的 cfDNA 水平升高。 [50]这种升高与患者两年内额外心脏问题甚至死亡率的结果相关。 [51]

移植物排斥反应

外源 cfDNA 已被证明存在于实体器官移植患者的血浆中。该 cfDNA 来自移植器官，称为 dd-cfDNA（供体来源的无细胞 DNA）。 DdcfDNA 值在移植手术后最初会出现峰值 (>5%)，其值在很大程度上取决于移植的器官，通常会在一周内下降 (<0.5%)。 [52]如果宿主身体排斥移植器官，则血液（血浆）中的 ddcfDNA 浓度将升至比无并发症者高 5 倍以上的水平。 ddcfDNA 的这种增加可以在任何其他临床或生化并发症迹象之前检测到。 [52]除了血浆中的ddcfDNA外，一些研究还关注ddcfDNA通过尿液的排泄。这在肾同种异体移植中特别令人感兴趣。当使用靶向下一代测序测量 ddcfDNA 时，使用群体特异性全基因组SNP组合进行检测。 [53]在文库制备过程中，在NGS之前将条形码附加到连接的接头上，可以实现绝对 ddcfDNA 定量，而无需事先进行供体基因分型。如果将 cfDNA 拷贝的绝对数量与来自受者的 ddcfDNA 相对于 cfDNA 的分数结合起来，以确定同种异体移植物是否被排斥，这已被证明可以提供额外的临床益处。 [53]


未来发展方向

cfDNA 提供了一种快速、简单、非侵入性和重复性的采样方法。这些生物学特征和采样的技术可行性相结合，将 cfDNA 定位为具有巨大用途的潜在生物标志物，例如用于自身免疫性风湿病和肿瘤。它还提供了一种潜在的生物标志物，与侵入性组织活检相比，它具有自身的优势，可以作为检测移植排斥和免疫抑制优化的定量措施。然而，该方法在样本类型（血浆/血清/滑液/尿液）、样本采集/处理方法、游离或细胞表面结合 DNA、cfDNA 提取和 cfDNA 定量以及呈现和解释方面缺乏统一性定量 cfDNA 结果。

cfDNA通过荧光方法定量，例如PicoGreen染色和紫外光谱法，更灵敏的是重复元件或看家基因的定量聚合酶链反应（ PCR ；SYBR Green或TaqMan），或深度测序方法。循环核小体是染色质中 DNA 组织的主要重复单位，可通过酶联免疫吸附测定 ( ELISA ) 进行定量。 [54]

数据库

NucPosDB：体内核小体定位和游离 DNA 核小体的数据库

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