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西方墨點法

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西方墨點法使用抗体识别修改的硫辛酸蛋白.

西方墨點法英语Western blot)或稱「蛋白質轉漬法」、「免疫墨點法」(immunoblot)或「西式吸印雜交」,是分子生物学生物化学免疫遗传学中常用的一种实验方法,也是HIV檢測的方法之一。

利用特定抗體能夠專一結合其抗原蛋白質的原理來對樣品進行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息,來分析檢測特定蛋白質的生物學檢測技術。

发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。[1]在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为“Western印迹法”。

原理[编辑]

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

實驗步驟[编辑]

實驗大至分為鑄膠、跑膠、轉印、接一級抗體、接二級抗體以及壓片幾個部分。

组织准备[编辑]

样品可以从整个组织中或从细胞培养物中提取。固体组织首先使用(对于较大样品体积)搅拌机的机械方式打破,使用均化器(小体积),或通过超声处理。

SDS-PAGE sample.png

凝膠電泳[编辑]

样品的蛋白质是使用凝胶电泳分离。蛋白质的分离可通过等电点(pI),分子量,电荷,或这些因素的组合。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是识别蛋白质非常有用的方法。

SDS-PAGE Electrophoresis.png

另外,也可以使用一个两维(2-D)的凝胶在两个维度上来传播来自单个样品的蛋白质。蛋白质在第一维分离是根据它们的等电点(pH为它们具有的中性净电荷),并在第二维分离是根据它们的分子量。

转移[编辑]

为了使蛋白质接触到抗体检测,它们是从凝胶中转移到由硝化纤维聚偏二氟乙烯(PVDF)的膜。用于将蛋白转移的主要方法称为"电印迹"(Electroblotting)并且使用电流从凝胶进入PVDF或硝化纤维素膜拉出蛋白质。

Western blot transfer.png

阻拦[编辑]

检测[编辑]

在检测过程中,膜被“探测”为了目标蛋白质与修饰的抗体被连接到一种报告酶; 当暴露于适当的底物时,这种酶驱动比色反应并产生颜色。由于各种原因,这传统上发生在一个两步法的过程中,虽然现在某些应用中可以用一步法的检测方法。

两步法[编辑]

Western Blot binding.png

一步法[编辑]

西方墨点法使用放射性检测系统.

分析[编辑]

在未结合的探测剂被洗去之后,西方墨点法准备好检测被标记和结合到目标蛋白质的探测剂。在实际应用中,并不是所有的西方墨点法揭示蛋白质仅在一种膜上的一个条带。

分类[编辑]

Western Blot显色的方法主要有以下几种:

  • 放射自显影
  • 底物化学发光ECL
  • 底物荧光ECF
  • 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

医学诊断应用[编辑]

  • 确证HIV檢測采用西方墨點法以检测在人血清样品中的抗-HIV抗体。
  • 西方墨點法还用作决定性测试牛海绵状脑病(BSE,通常被称为“疯牛病”)。
  • 某些形式的莱姆病检测用西方墨點法。
  • 西方墨點法也可以被用来作为乙型肝炎病毒感染的确定测试。
  • 在兽医中,西方墨點法有时被用于确认猫的貓免疫缺陷病毒FIV+状态。

參見[编辑]

参考文献[编辑]

  1. ^ Alwine J, Kemp D, Stark G,. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977, 74 (12): 5350–5354. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220. 

外部链接[编辑]