逆转录酶

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逆转录酶
Reverse Transcriptase 1HMV.png
HIV逆转录酶晶体学结构(绿色部分为P51亚基,蓝绿色部分为P66亚基。[1]
鉴定
标志 RVT_1
Pfam(蛋白家族查询站) PF00078
InterPro(蛋白数据整合站) IPR000477
PROSITE(蛋白数据站) PS50878
SCOP(蛋白结构分类数据站) 1hmv
依赖于RNA的DNA聚合酶

(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP)

识别码
EC编号 2.7.7.49
CAS号 9068-38-6
数据库
IntEnz IntEnz浏览
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KEGG KEGG入口
MetaCyc 代谢路径
PRIAM 概述
PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
基因本体 AmiGO / EGO

逆转录酶是一类存在于部分RNA病毒中具有逆转录活性、能以单链RNA为模板合成DNA。由逆转录酶催化逆转录合成的DNA称为互補DNA(cDNA)。

通常情况下,细胞内的转录是以DNA为模板合成RNA的,所得RNA为信使RNA(mRNA)供蛋白质合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要实现自身的扩增,必须具有DNA,因此先由RNA逆转录合成cDNA再由cDNA转录出RNA。

逆轉錄酶可用於RT-PCR,將RNA轉變爲DNA後擴增,以獲得RNA的序列。

這些活化因子會將反轉錄病毒裡的單股RNA轉化成雙股cDNA並且將之插入宿主細胞的基因裡,在一段時間內繁殖。相同的反應被廣泛的應用在實驗室中將RNA轉換成DNA如分子克隆RNA測序聚合酶鏈反應(PCR),或是DNA微陣列。 良好的反轉錄酶研究物質包含:

反轉錄酶是在美國威斯康星大學麥迪遜分校中的勞氏肉瘤病毒霍华德·马丁·特明(Howard Martin Temin)發現的,[2]並且1970在麻省理工學院戴维·巴尔的摩(David Baltimore)獨立從兩種RNA腫瘤病毒:R-MLV以及再一次勞氏肉瘤病毒中分離出來。.[3]由於這些成就,兩人在1975年共同獲得了诺贝尔生理学或医学奖(和罗纳托·杜尔贝科(Renato Dulbecco)

反轉錄這種想法因為違背了分子生物學中心法則,即DNA轉錄成RNA再轉譯成蛋白質的過程,因此非常不受到歡迎。然而,在1970時,當科學家霍华德·马丁·特明戴维·巴尔的摩兩人各自都從酵素中發現反轉錄的反應,將此命名為反轉錄酶,此種反轉錄的機制才被當時的主流接受。[4]

病毒的功能[编辑]

反轉錄酶在反轉錄病毒裡是用來在複製以及編碼的反應過程中。反轉錄RNA病毒像是反轉錄病毒,利用該酵素將他們的RNA基因組轉換成DNA,再將該DNA送至宿主細胞中,並且和宿主細胞的基因組一起進行複製。反轉錄DNA病毒,像是嗜肝DNA病毒,可以在組裝時,將RNA當作模板製造出DNA。HIV藉由此酵素感染人類。若是沒有反轉錄酶,這些病毒的基因組就不能和宿主細胞結合,進而導致複製失敗。

反轉錄的過程[编辑]

反轉錄酶從RNA模板中製造出單股DNA。在缺乏DNA-dependent DNA聚合酶的病毒中,雙股DNA的製造可以經由宿主編碼DNA聚合酶δ完成,過程中可能會將病毒的DNA-RNA引子誤認並且藉由和引子去除類似的機制合成出雙股DNA,而在新的合成的DNA即取代了舊有的RNA模板。反轉錄的過程的錯誤率很高,因此在整個步驟中突變有很大的機會會發生。這種突變的現象可能會形成病毒的抗藥性

反轉錄病毒的反轉錄[编辑]

Reverse transcription.svg

反轉錄病毒,或稱VIssRNA-RT病毒,是用DNA當作中間產物的RNA反轉錄病毒。他們的基因組通常由兩個正感知且有5’端帽3’端聚線苷酸尾的單股RNA。反轉錄酶如人類免疫缺乏病毒(HIV)和人類T淋巴細胞病毒HTLV。在細胞質中製造雙股DNA的過程有以下步驟[5]

  1. 由特殊細胞的tRNA當作引子,並且和互補的病毒基因組進行雜交,稱為引子黏接位或PBS。
  2. 互補DNA接下來和病毒RNA的U5(非編碼區)和R區(在RNA的兩邊末端的重複區域)結合。
  3. 在反轉錄酶上的核糖核甘酸酶H會將用來移除U5和R區的5’端的RNA降解。
  4. 引子接下來會跳到病毒基因組中的3’端並且和新製造的一股DNA在RNA上雜交組合成互補的R區。
  5. 第一股互補DNA(cDNA)會被延展並且病毒的主要RNA會被RNAse H降解。
  6. 一旦一股完成了,第二股就會從病毒的RNA的一開始進行合成
  7. 接下來另外一個引子就會跳到第二股的PBS處,與第一股互補的PBS進行雜交
  8. 雙股會被延展並藉由整合酶被併入宿主細胞

製造雙股DNA也牽涉到股的轉移,即從一開始的RNA dependent DNA合成出來較短的DNA轉移至其他基因組模板中的受體,而此受體接下來會藉由反轉錄酶進行DNA-dependent DNA的活化。[6]

反轉錄病毒的RNA在5’端和3’端被重新排列。引子黏接在RNA病毒的位置的區域稱為引子結合區(PBS)。PBS區的5’端稱為U5,而PBS的3’端稱為領先區。tRNA的引子在14和22區的核甘酸被解開且和病毒的RNA與PBS形成鹼基對。事實上PBS在病毒的RNA的5’端上是不正常的,因為反轉錄酶是從3’端合成出DNA,方向是5’到3’(相對於RNA模板)。因此引子和反轉錄酶必須位在病毒的RNA的3’端。為了成功的將之重新定位,需要許多的步驟以及酵素,包含DNA聚合酶,RNAse H以及已解開的的聚合苷酸來參與反應。[7]

HIV的反轉錄酶也有核糖核甘酸酶用來活化,目的是將在合成cDNA的過程中將病毒的RNA降解,如同DNA dependent DNA聚合酶將cDNA股合成為無意義的DNA來組成病毒的雙股DNA中間產物(vDNA)。[8]

在真核生物[编辑]

自行複製真核細胞的延長基因組稱為反轉錄轉座子,藉由反轉錄酶去移除RNA的其中一個位置。他們在植物和動物中的基因組中大量發現。端粒酶是另外一種反轉錄酶,在許多真核生物,像是有自己的RNA模板的人類中發現,這些RNA會被用來當作DNA複製的模板。 [9]

在原核生物[编辑]

反轉錄酶亦從細菌的Retron msr RNAs,一種特殊的片段,由反轉錄酶編碼,且拿來合成msDNA。合成DNA時需要引子。在細菌裡,引子的合成是在複製的過程中製造。 [10]

構造[编辑]

反轉錄酶包含RNA-dependent DNA聚合酶和DNA-dependent DNA聚合酶,兩者一起用來表現轉錄的過程。在一開始轉錄因子中,反轉錄病毒的反轉錄酶有RNase H家族的重要區域。

複製保真度[编辑]

反轉錄病毒的生活史中有三種不同的複製系統。第一種,反轉錄酶從病毒的RNA合成出病毒的DNA,進而製造出新的互補DNA。第二種複製方式則是在宿主細胞的DNA聚合酶開始複製黏合上去的病毒DNA後,RNA聚合酶II就會將原病毒的DNA轉錄成之後和病毒顆粒包裝在一起的RNA。因此,突變可以在這些步驟中發生。 [11]

反轉錄酶在將RNA變成DNA時有很高的錯誤率,不像其他的DNA聚合酶,他沒有校正的功能。這種較高的錯誤率相對於有校正的複製過程,可以促進突變的累積。一般市面上由Promega購買到的反轉錄酶,說在AMV中有每17000個鹼基就有一個是突變的,而在M-MLV中每30000個鹼基就有一個是突變的。[12]

除了創造單核甘酸的基因多樣性外,反轉錄酶也在一些步驟初級產物融合外顯子重組並且做出人造的反義RNA轉錄產物。[13][14]這種模板的切換被推測,這種可以完整的在體內中進行反應的反轉錄酶,通常有著可以找出在模式生物中數千個未註明的轉錄產物。[15]

應用[编辑]

The molecular structure of zidovudine(AZT),a drug used to inhibit HIV reverse transcriptase

抗病毒藥物[编辑]

更多有關抗病毒藥物的細節,請參照反轉錄酶抑制劑。當HIV利用反轉錄酶將基因的物質複製並且產生出新的病毒(部分反轉錄病毒的增殖圈)。特殊的藥物被設計成用來阻斷反轉錄酶反應的過程,並且抑制反轉錄病毒的生長。總體來說,這些藥物被稱作反轉錄酶抑制劑且包含核甘以及核甘酸相似的物質,齊多夫定(商品名稱為多夫),拉米夫定(博路定),和非核甘抑制劑,奈韋拉平(維樂命)。

分子生物學[编辑]

更多有關分子生物學的細節,請參照反轉錄聚合酶鏈反應。反轉錄酶常用來應用在聚合酶鏈反應這種研究方式中,以RNA為主的技術稱作反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。典型的PCR技術只能用來用在DNA上,但是有著反轉錄酶的幫助下,RNA亦可以被反轉錄成DNA,因此使PCR可以分析RNA分子。反轉錄酶也同時被應用在從MRNA製作cDNA基因庫,市面上買的到的反轉錄酶通常在分子生物界裡都是被改良過的。其他酵素允許科學家用來進行客隆,或者定義RNA。

反轉錄酶也被拿來用在胰島素的製作。藉由將真核細胞的胰島素的mRNA和反轉錄酶注入細菌中,mRNA就可以被插在原生生物的基因組裡。大量的胰島素就會被製造,可以用來取代從豬隻的胰島萃取等的傳統方式。直接將真核細胞的DNA注入到細菌的染色質裡。在真核細胞mRNA的生產過程中,去除內含子,並且提供一個適當的模板。反轉錄酶將RNA重新編成DNA因此可以拿來和基因組黏合。

參見[编辑]

参考文献[编辑]

  1. ^ PDB 1HMV; Rodgers DW, Gamblin SJ, Harris BA, Ray S, Culp JS, Hellmig B, Woolf DJ, Debouck C, Harrison SC. The structure of unliganded reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus type 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995.February, 92 (4): 1222–6. doi:10.1073/pnas.92.4.1222. PMC 42671. PMID 7532306. 
  2. ^ Temin HM, Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature. 1970.June, 226 (5252): 1211–3. doi:10.1038/2261211a0. PMID 4316301. 
  3. ^ Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 1970.June, 226 (5252): 1209–11. doi:10.1038/2261209a0. PMID 4316300. 
  4. ^ Central dogma reversed. Nature. 1970.June, 226 (5252): 1198–9. doi:10.1038/2261198a0. PMID 5422595. 
  5. ^ Bio-Medicine.org - Retrovirus Retrieved on 17 Feb, 2009
  6. ^ Telesnitsky A, Goff SP. Strong-stop strand transfer during reverse transcription//In Skalka, M. A., Goff, S.P. Reverse transcriptase 1st. New York: Cold Spring Harbor. 1993. 49. ISBN 0-87969-382-7. 
  7. ^ Bernstein A, Weiss R, Tooze J. RNA tumor viruses//Molecular Biology of Tumor Viruses 2nd. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. 1985. 
  8. ^ Doc Kaiser's Microbiology Home Page > IV. VIRUSES > F. ANIMAL VIRUS LIFE CYCLES > 3. The Life Cycle of HIV Community College of Baltimore County. Updated: Jan., 2008
  9. ^ Krieger M, Scott MP, Matsudaira PT, Lodish HF, Darnell JE, Zipursky L, Kaiser C, Berk A. Molecular cell biology. New York: W.H. Freeman and CO. 2004. ISBN 0-7167-4366-3. 
  10. ^ Hurwitz J, Leis JP. RNA-dependent DNA polymerase activity of RNA tumor viruses. I. Directing influence of DNA in the reaction. J. Virol. 1972.January, 9 (1): 116–29. PMC 356270. PMID 4333538. 
  11. ^ Bbenek K, Kunkel AT. The fidelity of retroviral reverse transcriptases//In Skalka, M. A., Goff, P. S. Reverse transcriptase. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993. 85. ISBN 0-87969-382-7. 
  12. ^ Promega kit instruction manual (1999)
  13. ^ Houseley J, Tollervey D. Apparent non-canonical trans-splicing is generated by reverse transcriptase in vitro. PLoS ONE. 2010, 5 (8): e12271. doi:10.1371/journal.pone.0012271. PMC 2923612. PMID 20805885. 
  14. ^ Zeng XC, Wang SX. Evidence that BmTXK beta-BmKCT cDNA from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch is an artifact generated in the reverse transcription process. FEBS Lett. 2002.June, 520 (1-3): 183–4; author reply 185. doi:10.1016/S0014-5793(02)02812-0. PMID 12044895. 
  15. ^ van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR. Response to "The Reality of Pervasive Transcription". PLoS Biology. 2011, 9 (7): e1001102. doi:10.1371/journal.pbio.1001102. 

站外連結[编辑]