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考马斯亮蓝

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考马斯亮蓝R-250
Skeletal formula of Coomassie Brilliant Blue R-250
Space-filling model of the Coomassie Brilliant Blue R-250 molecule
别名 C.I. 42660, C.I. Acid Blue 83
Brilliant indocyanine 6B, Brillantindocyanin 6B
Brilliant Cyanine 6B, Serva Blue R
识别
CAS号 6104-59-2  checkY
PubChem 61365
SMILES
 
  • CCN(CC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)[O-])C2=CC=C(C=C2)C(=C3C=CC(=[N+](CC)CC4=CC(=CC=C4)S(=O)(=O)[O-])C=C3)C5=CC=C(C=C5)NC6=CC=C(C=C6)OCC.[Na+]
性质
化学式 C45H44N3NaO7S2 (Sodium salt)
摩尔质量 825.97 g/mol g·mol⁻¹
溶解性（水） Insoluble in cold, slightly soluble in hot (bright red blue)
溶解性（ethanol） Slightly soluble
若非注明，所有数据均出自标准状态（25 ℃，100 kPa）下。
Coomassie Brilliant Blue G-250
别名 C.I. 42655, C.I. Acid Blue 90
Brilliant indocyanine G, Brillantindocyanin G
Xylene Brilliant Cyanine G, Serva Blue G
识别
CAS号 6104-58-1
PubChem 6324599
SMILES
 
  • CCN(CC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)[O-])C2=CC(=C(C=C2)C(=C3C=CC(=[N+](CC)CC4=CC (=CC=C4)S(=O)(=O)[O-])C=C3C)C5=CC=C(C=C5)NC6=CC=C(C=C6)OCC)C.[Na+]
KEGG D10799
性质
化学式 C47H50N3NaO7S2 (Sodium salt)
摩尔质量 856.03 g/mol g·mol⁻¹
溶解性（水） Slightly soluble in cold, soluble in hot (bright blue)
溶解性（ethanol） Soluble
若非注明，所有数据均出自标准状态（25 ℃，100 kPa）下。

考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）是两种三苯甲烷衍生物染料（G-250和R-250）的统称，起初开发用于纺织行业，但现在通常用于分析生物化学中的蛋白质染色。考马斯亮蓝G-250比考马斯亮蓝R-250多两个甲基。其名“考马斯”是帝国化学工业下的一个注册商标。

起名和发现

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考马斯这个名字最初在19世纪末被一家设在英国布莱克利（Blackley）的染料公司（Levinstein Ltd.）作为贸易名使用，用来售卖一些酸性羊毛染料。[1]

1896年在第四次英国-阿散蒂战争期间, 英国军队占据了考马斯镇（今加纳库马西）。

1918年， Levinstein Ltd.公司并入不列颠染料公司（British Deystuffs Cororation) ，后者在1926年成为帝国化学工业的一部分。[2]虽然帝国化学工业公司仍然持有考马斯这种商标，可是他们没有再生产这种染料。

这些蓝色的二磺酸化三苯甲烷的染料首先在1913年由住在德国Elberfeld的Max Weiler生产[3]后来陆续发现了多种有机化学合成这种染料的方法。Var[4][5][6]目前发表的生化论文中，通常把这些染料统称“考马斯”而不区分具体用的是哪种染料。实际上国际颜色索引列出了超过了四十种名字含有“考马斯”的染料，也有一些其他种类的（非二磺酸化三苯甲烷）的染料，也被叫作“考马斯”蓝。例如默克索引（第10版）列出了具有完全不同的结构的考马斯蓝。

染料的颜色

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后缀带R的考马斯亮蓝R-250，R意指红色，这是因为考马斯亮蓝R-250在蓝色中略带有红色；而G型则意指Green，在蓝色中带有一点绿色。250起初是指染料的纯度。

这两种染料的颜色与溶液的酸堿性有关。考马斯亮蓝G型已经研究得比较详细。[7] 在pH低于0的时候，呈现红色，最大吸收峰位于465nm。在pH值约为1时，这种染料呈现绿色，最大吸收峰位于约620nm处。当pH高于2时，这种染料呈现一种亮蓝色，最大吸收峰位于595nm。在pH为7的时候，这种染料的莫耳吸光度是43,000 M−1cm−1.[7]

染料分子呈现不同颜色的原因是分子不同的带电荷状态。在红色形态时，全部三个氮原子均带有正电。两个磺酸基团有相当低的酸度系数，通常会带负电，因而在pH为0左右时，整个染料分子会带1个正电荷。绿色的形态则对应整体不带电荷。而在中性介质（pH7）中，仅有二苯胺官能团上的氮原子带有一个正电荷，所以整个分子带有一个负电荷而呈蓝色。这三个氮原子中前两个失去质子的pKa分别是1.15和1.82。最后一个氮原子在强堿性环境下会失去质子，从而使染料变为粉色（pKa是12.4）[7]。

考马斯亮蓝和蛋白质的氨基、羧基基团产生静电作用，而非共价作用。染料分子和蛋白分子包括羊毛（角蛋白）形成一个蛋白质-染料分子复合物。 这种复合物的形成，使得染料的带负电荷的形态得到了稳定，从而产生蓝色，即使在多数分子带正电荷的强酸环境下。[7] 这是布拉德福蛋白质定量法的理论依据，是一种利用考马斯亮蓝与蛋白质结合的蛋白质测定方法。这种染料与蛋白质的结合，使得考马斯亮蓝的吸收峰从465nm迁移到595nm。记录595nm处吸光度的增加，可以用来测定蛋白质浓度。[8]

这种染料也会与阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠形成复合物。[9]这使得染料分子的绿色形态得到稳定。这个效应可以干扰布拉德福蛋白质定量法的测定。阴离子去垢剂也有可能与蛋白质竞争和染料分子结合。

生物化学中的用途

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考马斯亮蓝R-250在1964年被Fazekas de St.Groth的团队最先用来观察蛋白。蛋白样品在醋酸纤维素薄膜上进行电泳分离。薄膜随后被放置于5-磺基水杨酸中，使蛋白质条带固定，然后将膜浸到染料溶液中。[10]

两年之后，1965年Meyer和Lambert用考马斯亮蓝R-250去染经聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质样品。他们将胶浸在含有甲醇乙酸和水的溶液中。由于染料在染色蛋白质的同时也染了聚丙烯酰胺凝胶，为了使蛋白质条带可见，他们对电泳的凝胶进行了脱色。[11]后续的文献报道聚丙烯酰胺凝胶可以被乙酸溶液成功脱色。

在1967年，首次出现使用考马斯亮蓝G让聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白条带变得可见的报道，其中染料被溶解在含有甲醇的乙酸溶液中。[12]之后发现，如果使用溶解在不含甲醇的三氯乙酸考马斯亮蓝G胶体，可以使蛋白质条带被染色，而聚丙烯酰胺不被染色。如果用这种方法，就没有必要再对胶进行脱色。[13]现代的手段通常是将考马斯亮蓝G溶解在含有磷酸、乙醇（或甲醇）和硫酸铵（或硫酸铝）的溶液中。[14][15][16][17]

布拉德福蛋白质定量法利用了考马斯亮蓝G-250的光谱性质去检测溶液中的蛋白质含量。[18]将蛋白质样品加入到染料的磷酸和乙醇的溶液中。在酸性环境中，这种染料通常呈现棕红色，但是结合了蛋白质之后，染料形成蓝色形态。溶液的吸光度在595nm波长处测定。这种染料非常著名，因为它有高灵敏性，即使只有5μg蛋白也足以使染料变色。然而，这种方法有一个缺点是变色程度因蛋白质种类不同而不同：单位量蛋白质带来的吸光度改变取决于蛋白质的类型。[19]

与蛋白质结合后，带负电荷的考马斯亮蓝G-250分子会让蛋白质整体带上负电荷。这个性质可以被用来分离蛋白质或蛋白质复合物，使用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳——Blue Native PAGE电泳。[20][21]这样的复合体的迁移能力既取决于蛋白质复合体的分子质量，也取决于结合到蛋白质上的染料量。

考马斯亮蓝染色，也可以用于western印迹分析中的一步。[22]它的作用是先于抗体的染色，使之可以作为对照。

药理用途

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2009年，考马斯亮蓝G在实验中被用来治疗实验室大鼠的脊髓损伤。[23]它通过减少个体肿胀反应而生效，而肿胀反应会导致损伤区域的神经元死于代谢的压力。这个方法在大鼠上测试有效。两组脊髓损伤大鼠中，一组给予考马斯亮蓝G处理，一组没有处理。测试结果证明，相较于没有处理的大鼠，用染料处理的大鼠可以更好的运动，并且在运动测试中取得更高的得分。[24] 这种治疗能否用在人类身上的相关测试还在进行中。近期的实验中曾在损伤后15分钟后，施予染料治疗有效。但是在现实生活中，病人需要一定时间才能赶到急救室，所以这种治疗应该即使在受伤后两小时后施放仍然有效。唯一报道的副作用是大鼠会短暂的变蓝。[23][25][26]

亮蓝G作为染料可以被外科医生使用来完成视网膜手术，它的贸易名是Brilliant Peel.[27]

法医学应用

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纽约州立大学奥尔巴尼分校的一个实验，反应了考马斯染料可以去靶向结合芳香族氨基酸（苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸）和碱性侧链氨基酸（赖氨酸，精氨酸和组氨酸），从而使得布拉德福分析可以用来做指纹的分析。布拉福德分析已经可以成功的用来检测指纹的男女属性。女性指纹样品相较于男性指纹样品，会带来更高的吸收峰（在相近波长下）。这提供了一种更简单的指纹分析方法，将需要分析的氨基酸数从23个减少到了6个，而且相对于茚三酮化学测定方法，需要的准备工作量更少，因为茚三酮测定法需要加热、酶联反应等。[28]

参考文献

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  1. ^ Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. Manchester: Imperial Chemical Industries. 1987: 38. 
  2. ^ Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. Manchester: Imperial Chemical Industries. 1987: 259. 
  3. ^ Colour Index (PDF) 4 3rd. Bradford: Society of Dyers and Colourists. 1971: 4397–4398 [2018-04-10]. （原始内容 (pdf)存档于2011-07-19）. 
  4. ^ FR patent 474260,“Procédé de production de colorants de la série du triarylméthane”,发行于1915-02-16,指定于Bayer 
  5. ^ US patent 1218232,Weiler, Max,“Blue Triphenylmethane Dye”,发行于1917-03-06 
  6. ^ GB patent 275609,“Manufacture of Triarylmethane-dyestuffs”,发行于1927-11-03,指定于IG Farbenindustrie 
  7. ^ 7.0 7.1 7.2 7.3 Chial, H. J.; Thompson, H. B.; Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 1993, 209 (2): 258–266. PMID 7682385. doi:10.1006/abio.1993.1117. 
  8. ^ Bradford, Marion M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (PDF). Analytical Biochemistry. 1976, 72: 248–254 [2018-04-10]. PMID 942051. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3. （原始内容 (PDF)存档于2021-02-27）. 
  9. ^ Compton, S. J.; Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 1985, 151 (2): 369–374. PMID 4096375. doi:10.1016/0003-2697(85)90190-3. 
  10. ^ Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochimica et Biophysica Acta. 1963, 71: 377–391. PMID 18421828. doi:10.1016/0006-3002(63)91092-8. 
  11. ^ Meyer, T. S.; Lambert, B. L. Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica et Biophysica Acta. 1965, 107 (1): 144–145. PMID 4159310. doi:10.1016/0304-4165(65)90403-4. 
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  16. ^ Steinberg, T. H. Protein gel staining methods: an introduction and overview. Methods in Enzymology. Methods in Enzymology. 2009, 463: 541–563. ISBN 9780123745361. PMID 19892191. doi:10.1016/S0076-6879(09)63031-7. 
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  22. ^ Welinder, Charlotte; Ekblad, Lars. Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis. Journal of Proteome Research. 2011, 10 (3): 1416–1419. doi:10.1021/pr1011476. 
  23. ^ 23.0 23.1 Peng, W.; Cotrina, M. L.; Han, X.; Yu, H.; Bekar, L.; Blum, L.; Takano, T.; Tian, G. F.; et al. Systemic administration of an antagonist of the ATP-sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009, 106 (30): 12489–12493. PMC 2718350 可免费查阅. PMID 19666625. doi:10.1073/pnas.0902531106. 
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  26. ^ Blue Food Dye Treats Spine Injury in Rats. Wired.com. 2009-07-27 [2010-01-19]. （原始内容存档于2014-02-27）. 
  27. ^ Mennel, S.; Meyer, C. H.; Schmidt, J. C.; Kaempf, S.; Thumann, G. Trityl dyes patent blue V and brilliant blue G - clinical relevance and in vitro analysis of the function of the outer blood-retinal barrier. Developments in Ophthalmology. Developments in Ophthalmology. 2008, 42: 101–114. ISBN 978-3-8055-8551-4. PMID 18535384. doi:10.1159/000138988. 
  28. ^ Brunelle, Erica; Le, Anh Minh; Huynh, Crystal; Wingfield, Kelly; Halámková, Lenka; Agudelo, Juliana; Halámek, Jan. Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye: An Application for Forensic Fingerprint Analysis. Analytical Chemistry. 2017-04-04, 89 (7): 4314–4319. ISSN 0003-2700. doi:10.1021/acs.analchem.7b00510. 

延伸阅读

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  • Gessner, T.; Mayer, U. Triarylmethane and Diarylmethane Dyes. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 6th Edition. Weinheim: Wiley-VCH. 2002. ISBN 3527306730. doi:10.1002/14356007.a27_179{{inconsistent citations}} 

外部链接

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